白酒酒糟中產纖維素酶細菌的分離篩選和酶學性質研究

宋麗麗，聞格，霍姍浩，胡曉龍,2，楊旭，張志平

1(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450001) 2(河南仰韶酒業有限公司 博士后創新實踐基地，河南 三門峽，472000)

纖維素在自然界中來源豐富且分布廣泛，是地球上數量巨大的可再生資源。工農業生產過程中常產生大量的纖維質廢棄物，如農作物秸稈、白酒酒糟、食品加工廢棄物、林業加工下腳料等，但這部分資源并沒有得到合理有效的利用，不僅造成極大的資源浪費而且產生環境污染等問題。利用微生物生產的纖維素酶，將植物性纖維原料轉化為人類急需的能源、食品和化工原料，對解決全球能源危機、食品和飼料資源緊張以及緩解環境問題等有著重大意義[1]。纖維素酶是一類多酶復合體，主要由內切型葡萄糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶3大類具有不同催化反應功能的酶組成[2]。自然界中能產纖維素酶的微生物種類繁多，主要包括真菌、放線菌和部分酵母菌、細菌等[3]。長期以來，高產菌株缺乏一直是制約纖維素酶大規模工業化生產的瓶頸，因此篩選得到優良的菌株是實現纖維素酶批量生產的關鍵[4]。

我國是白酒生產大國，酒糟是白酒釀造中數量最大的副產物，其主要成分是纖維素和木質素，同時含有部分蛋白質、淀粉和粗脂肪等[5]。新鮮酒糟具有水分含量高、酸度大、有機質含量高等特點，由于纖維質及有機酸含量較高，生物利用度較低[6-7]，若不及時處理極易腐敗變質，造成環境污染及資源浪費。白酒酒糟中纖維素的降解轉化對于酒糟的綜合利用具有潛在的經濟價值，實現酒精資源的綜合利用將有助于白酒企業的可持續發展。白酒的固態釀造具有開放式生產、多菌種共發酵的特點，其發酵副產物中含有豐富的微生物資源。曾林等[8]從白酒黃水中篩選得到18株產纖維素酶的菌株。其中SW02被鑒定為植物內生芽孢菌(Bacillusendophyticus)，其濾紙酶活力為30.48 U/mL。董丹等[9]從白酒酒糟中篩選出3株高產纖維素酶菌株，經鑒定分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、甲基營養型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)。由于細菌纖維素酶活力不如真菌，前期研究多集中于真菌源纖維素，如曲霉、木霉、白耙齒菌等[10-12]，但細菌源纖維素酶具有耐酸堿性、耐熱性、生產周期短、易于培養等優點[13-14]。因此，對產纖維素酶細菌的篩選研究仍然具有重要的意義。

筆者從白酒酒糟中篩選到1株產纖維素酶的細菌，對其進行形態觀察、分子生物學鑒定和生理生化鑒定，并進一步研究其酶學特性，為進一步研究細菌纖維素酶生產菌株提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

白酒酒糟：采集于河南省某知名白酒企業。

1.1.2 試劑

葡萄糖、MgSO4、牛肉膏、蛋白胨、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)等常規生化試劑,上海國藥集團。羧甲基纖維素(carboxy methyl cellulose，CMC)、微晶纖維素、剛果紅、4-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG),美國Sigma公司。

1.1.3 培養基

(1)篩選培養基(剛果紅培養基)(g/L)：KH2PO40.5、MgSO4·7H2O 0.5、酵母粉0.4、瓊脂16.0、剛果紅0.2、CMC 10，121 ℃滅菌20 min。

(2)種子培養基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨 5、葡萄糖5、NaCl 5，121 ℃滅菌20 min。

(3)發酵產酶培養基(g/L)：KH2PO42、(NH4)2SO41.4、蛋白胨1、尿素0.3、CaCl20.34、MgSO4·7H2O 0.3、FeSO4·7H2O 0.005、MnSO40.001 6、ZnSO4·7H2O 0.001 4、CoCl20.002、CMC 10，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZWY-100H往復式恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；DMEX30生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；UV7504紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一生物科技有限公司；GNP-9160型隔水式恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；C1000聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀，美國伯樂公司；GelK8160凝膠成像系統，北京科創銳新生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株初篩

稱取10 g白酒酒糟混懸于100 mL無菌水中，置于磁力攪拌器充分混勻，取懸濁液稀釋為10-3、10-4和10-53個梯度，各稀釋梯度取100 μL涂布于剛果紅篩選培養基，37 ℃恒溫培養2 d，挑取水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值大的菌株進行復篩。

1.3.2 菌株復篩

將初篩的菌株純化，接種于種子培養基，37 ℃，180 r/min搖床培養24 h，以2%的接種量接種到100 mL發酵培養基，37 ℃、180 r/min 搖床培養48 h，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液即為粗酶液,測定粗酶液纖維素酶活力。

纖維素酶酶活力的測定：采用DNS法測定粗酶液酶活力[15]，取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL體積分數1%的CMC緩沖液(pH 4.8, 0.1 mol/L)，50 ℃反應30 min，加入2 mL DNS 沸水浴中顯色10 min，540 nm測定吸光度。酶活力的定義為：每分鐘催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 形態觀察

將菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體平板上觀察菌落形態特征。通過革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察菌株形態特征。

1.3.3.2 分子生物學鑒定[16]

基因組DNA試劑盒提取目的菌株總DNA，采用細菌16S rDNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增，將PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果在NCBI上用Blast進行同源檢索，利用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.3.3.3 生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[17]和《常見細菌系統鑒定手冊》[18]進行生理生化特征鑒定。包括V-P試驗、產吲哚試驗、糖發酵試驗、甲基紅試驗等。

1.3.4 菌株纖維酶素酶學性質分析

1.3.4.1 最適作用溫度及溫度穩定性

最適作用溫度：將酶液在不同溫度(30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃)條件下與體積分數1% CMC進行酶促反應，DNS法測定CMC酶活力。溫度穩定性：先將粗酶液置于30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃的水浴鍋中分別孵育30 min，然后進行酶促反應，DNS法測定殘余CMC酶活力。以最高酶活為100%，其他酶活則換算成相對于最高活力的百分比。

1.3.4.2 最適作用pH及pH穩定性[19]

最適作用pH：將CMC酶活測定反應體系pH值分別調整至pH 3.0～8.0，測定纖維素酶在不同pH條件下的CMC酶活。pH穩定性：將粗酶液分別置于于pH 3.0～8.0反應體系中，50 ℃保溫30 min，然后進行酶促反應，DNS法測定殘余CMC酶活力。以最高酶活為100%，其他酶活力則換算成相對于最高活力的百分比。

1.3.4.3 金屬離子對酶活力的影響

將終濃度為1 mmol/L的金屬離子Cu2+、Fe2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、K+、Ba2+分別添加至酶活力測定體系中，以不添加任何金屬離子組做對照(CK)，測定不同濃度各金屬離子對酶活力的影響。以最高酶活力為100%，其他酶活則換算成相對于最高活力的百分比。

1.3.4.4 底物特異性

將粗酶液加入到以微晶纖維素(1%)、濾紙條(50 mg)、CMC(1%)和pNPG(0.5%)為底物的反應體系中，按前述測酶活的方法，在最適溫度和最適pH條件下反應30 min(濾紙條為底物的體系反應60 min)，測定其在不同底物體系中粗酶液的活力。以最高酶活為100%，其他酶活力則換算成相對于最高活力的百分比。

1.4 數據處理

采用Excel 2010和Origin Pro 9.0進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶細菌的分離篩選

剛果紅可以與纖維素形成紅色的復合物，當纖維素被降解后，培養基會形成以菌落為中心的水解圈，根據水解圈(D)與菌落直徑(d)比以及水解圈的清晰程度可初步篩選出具有降解纖維素能力的菌株[20]。從白酒酒糟中共篩選出28株產纖維素酶細菌，以H/C值>8作為初篩標準，選取16株產纖維素酶能力較高的菌株，如表1所示。

表1 16株菌在剛果紅平板的透明圈直徑

注：“++++”為透明圈清晰可見；“+++”為透明圈較清晰；“++”為透明圈渾濁

其中YS21-4、YS19-6、YS9-2、YS10-2、YS13-2五株菌的D/d>10，且透明圈清晰，對CMC降解性能較好，菌株YS32-9雖然水解圈直徑較大，但菌落本身直徑也比較大，因此D/d值僅為8.8。由于菌株在剛果紅培養基上水解圈的大小與實際產酶能力不一定呈現一致的關系[21]，因此將初篩得到的16株菌進行進一步的發酵產酶復篩。

將初篩得到的16株細菌進行發酵產酶復篩，酶活見表2。其中菌株YS10-2胞外酶活力最高，為(36.73±2.45)U/mL，且在剛果紅平板上產生清晰的透明圈(圖1)，因此將YS10-2作為出發菌株，進行下一步的研究。

表2 16株菌產纖維素酶活力測定

A-對照菌株;B-纖維素酶產生菌YS10-2

2.2 菌株YS10-2的鑒定

2.2.1 菌株YS10-2的形態學特征

如圖2所示，菌株YS10-2在牛肉膏蛋白胨平板上菌落形態為乳白色，近圓形，表面較濕，富有光澤，不透明，顯微鏡下菌體呈桿狀，有芽孢，革蘭氏染色為陽性。

2.2.2 菌株YS10-2分子生物學鑒定

a-菌落形態；b-菌株形態

以菌株YS10-2總DNA為模板，采用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，檢驗得到約為1.5 kb條帶(圖3)，將目的菌株的16S rDNA序列和該屬有代表性細菌的16s rDNA序列構建的遺傳進化樹，如圖4所示。菌株YS10-2的16S rDNA 基因序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，為芽孢桿菌屬，與Bacillusmegaterium同源性最高，達到100%，判斷菌株YS10-2 屬于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。研究表明，芽孢桿菌做為益生菌具有促進機體消化吸收和增強免疫力的作用[22]，因此在酒糟再利用轉化為飼料方面具有應用潛力。

M-marker

圖4 基于16S rDNA序列菌株YS10-2的系統發育樹

2.2.3 菌株YS10-2生理生化鑒定

對菌株YS10-2進行生理生化鑒定，結果如表3。菌株YS10-2具有水解淀粉、吲哚陰性、接觸酶陽性及發酵糖產酸生理生化特性[17]，與巨大芽孢桿菌屬特征一致。

表3 菌株YS10-2的生理生化鑒定結果

注：-代表陰性結果，+代表陽性結果

2.3 纖維素酶酶學性質研究

2.3.1 纖維素酶最適溫度及溫度穩定性

考察不同溫度(30～70℃)對纖維素酶活性的影響，結果如圖5所示。YS10-2胞外粗酶液最適反應溫度為50 ℃，在40～55 ℃溫度范圍內，其酶活力在80%以上，高于60 ℃，酶活力逐漸下降，當反應溫度為70 ℃時，酶活力降至50%。

圖5 溫度對纖維素酶活力的影響

纖維素粗酶液經30～70 ℃處理30 min后，其酶活力變化情況如圖6所示。纖維素酶在30～55 ℃酶活均保持穩定(>80%)，當溫度高于60 ℃時，酶活力穩定性下降，70 ℃時，相對酶活力為50%，仍保持有一定的酶活力，說明菌株YS10-2所產的纖維素酶具有一定的熱穩定性。

2.3.2 纖維素酶最適pH及pH穩定性

如圖7所示，50 ℃條件下纖維素酶最適作用pH值為5.0，pH在4.0～5.5范圍內，纖維素酶的酶活在90%左右，該酶最適作用pH為弱酸性，當pH>6.0，酶活迅速下降，pH為8.0時，酶活力僅剩余20%，說明該酶不耐堿性條件。

圖6 纖維素酶熱穩定性

圖7 不同pH值對纖維素酶活力的影響

考察菌株YS10-2胞外粗酶液在不同pH條件下的穩定性，結果如圖8所示，該酶在pH 4.0～5.5范圍內，酶活力穩定在90%以上，當pH<3.5或pH>6.0時，其酶活力損失較多，穩定性變差，該酶在弱酸性條件下相對比較穩定。

圖8 不同pH值下纖維素酶的穩定性

2.3.3 金屬離子對纖維素酶活性的影響

考察不同金屬離子對纖維素酶活性的影響，以不添加任何金屬離子作為空白對照，由圖9可知，金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+是該酶的激活劑，酶活力分別增加28%、12%和26%，而Cu2+和Ba2+是該酶的抑制劑，添加后酶活力分別下降50%和60%，其他離子添加則對纖維素酶活力無顯著影響(P>0.05)。

圖9 不同金屬離子對纖維素酶活力的影響

2.3.4 纖維素酶最適作用底物

分別以CMC、微晶纖維素、濾紙、pNPG為底物測定YS10-2粗酶液的活力，如圖10所示，該酶對CMC的降解效果最好，其次為濾紙，對pNPG的降解性較差。纖維素酶為一種復合酶，主要是由葡聚糖外切酶、葡聚糖內切酶及β-葡萄糖苷酶組成[2]。CMC主要評價葡聚糖內切酶活力，微晶纖維素主要評價葡聚糖外切酶活力，pNPG為β-葡萄糖苷酶的水解底物[23-24]，通過對比不同底物降解性試驗，YS10-2所產胞外酶以葡聚糖內切酶為主，對CMC的降解具有一定的底物特異性，同時濾紙酶活力也較高。

圖10 纖維素酶對不同底物的水解活力

白酒釀造環境蘊含豐富的纖維素降解菌資源[25]，研究表明芽孢桿菌屬優勢菌，如植物內生芽孢桿菌[8]、枯草芽孢桿菌[9]、解淀粉芽孢桿菌[21]等，芽孢桿菌具有耐酸、耐堿、耐高溫等顯著優勢，作為益生菌，具有促進機體消化吸收等功效[22,26]。本研究篩選得到的YS10-2為巨大芽孢桿菌，對白酒釀造環境中芽孢桿菌屬纖維素降解菌資源是重要的補充。菌株YS10-2的纖維素酶活與現在報道的從白酒釀造環境篩選得到的芽孢桿菌產纖維素酶活相當[8-9,21,25]，對結構類似于天然纖維素的濾紙也有較高的酶活力，表明該菌株對白酒酒糟纖維質資源轉化利用具有應用潛力。

3 結論

本研究從白酒酒糟中篩選出1株纖維素酶菌株YS10-2，其CMC酶活力為(36.73±2.45)U/mL，經形態學觀察、分子生物鑒定及生理生化鑒定其為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。對菌株YS10-2所產纖維素酶酶學性質研究表明，其最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH為5.0，在30～55 ℃，pH為4.0～5.5范圍內，纖維素酶的穩定性較高。金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+是該酶的激活劑，而Cu2+和Ba2+則對酶活有抑制作用，該酶的最適反應底物為CMC，對濾紙的降解效果也較好。本研究為產纖維素酶菌株資源的開發利用提供補充，以期為白酒酒糟的綜合利用提供參考。