酵母菌-植物乳桿菌復合發酵菠蘿酵素生物活性的初步研究

趙治巧，曾莉，萬玉軍，王剛，唐自鐘*，布同良，陳惠，羅麗娟

1(四川農業大學 生命科學學院，四川 雅安,625014)2(四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都,611130)

菠蘿，又稱鳳梨，為四大熱帶名果之一[1]，富含Vc、碳水化合物和有機酸(主要為奎寧酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸和檸檬酸等)等成分[2]，具有健胃消食、治療咽炎和促進血液循環[3]的作用。它作為一種季節性強的水果，很難長期保存[4]，除可供鮮食之外，對其進行加工也是亟待解決的一個問題。

果蔬酵素是植物綜合酵素的一種，以一種或多種新鮮水果、蔬菜、蘑菇等純天然植物為原料[5]，經微生物發酵產生的富含酚類、有機酸、氨基酸、黃酮類等營養成分[6-7]和具有抗氧化、解酒護肝、改善腸胃狀況、凈化血液和潤腸通便[8-9]以及其他功效的新型產品。其主要酶類有脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)[10]。在食品發酵中，酵母菌、乳酸菌和醋酸菌是常用的發酵菌種[11]。果蔬經微生物作用后，在原有營養功能的基礎上還會帶來別的功效[12]。目前，關于果蔬酵素，很多學者致力于它的抗氧化研究。李凡等[13]通過復合發酵獲得白首烏酵素對超氧陰離子自由基和羥基自由基具有較強的清除能力；樊秋元等[14]研究發現接種發酵的黑加侖酵素抗氧化能力比自然發酵的抗氧化能力強；此結果與人參酵素抗氧化活性研究結果一致[15]。菠蘿酵素為菠蘿經酵母菌和植物乳桿菌復合發酵后獲得的發酵液，國內外對其研究報告較為少見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和果酒酵母(fruit wine yeast)，四川省食品發酵工業研究設計院；菠蘿，市售；福林酚試劑、3,5-二硝基水楊酸、苯酚，北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化試劑盒、α-淀粉酶試劑盒、總超氧化物歧化酶試劑盒，南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-25數顯pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海三發科學儀器有限公司；XZ18K-T高速冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；Multiskan Sky酶標儀，上海合商科學儀器有限公司；其他均為實驗室常規儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 菠蘿酵素的制作

制作工藝：選取新鮮菠蘿→去皮→切塊→裝瓶→加入酵母菌→補糖→加入乳酸菌→后熟→停止發酵→得發酵液。

1.3.2 樣品預處理

取發酵6個月的菠蘿酵素，經8 000 r/min離心20 min，取上清液作為試驗樣品備用。

1.3.3 菠蘿酵素化學成分含量的測定

總糖含量,參考文獻[5,16];總黃酮含量,參考文獻[17];總酚含量,參考文獻[5,18],蛋白質含量,參考文獻[5,19]。

1.3.4 功效酶活力測定

樣品處理：樣品經過20 min細胞破碎處理(破碎5 s、間歇5 s)，再低溫離心(8 000 r/min，15 min)，取上清液進行酶活力測定。

T-SOD活力測定，根據總超氧化物歧化酶活力測定試劑盒說明書進行;蛋白酶活力測定，參考文獻[16]；淀粉酶活力測定，采用碘-淀粉比色法測定(試劑盒)；脂肪酶活力測定，參考文獻[20]。

1.3.5 抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參考文獻[21]，準確配制0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，用蒸餾水稀釋樣品成不同體積分數(4%～28%)的待測樣。在酶標板上，加入100 μL DPPH溶液和100 μL梯度樣品溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，于λ=517 nm處測OD值。以無水乙醇作為空白對照，Vc(0.01～0.07 mg/mL)為陽性對照。按公式(1)計算清除率：

(1)

式中：A1，樣品管吸光度；A2，樣品本底管的吸光度；A0，空白對照管的吸光度。

1.3.5.2 ·OH清除能力

參考文獻[21-22]，將樣品稀釋成不同體積分數(8%～56%)的待測樣。取50 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 6 mmol/L H2O2溶液，200 μL酵素溶液，搖勻，靜止10 min，再加入50 μL 6 mmol/L水楊酸溶液，50 μL體積分數70%乙醇，搖勻，37 ℃反應30 min。于λ=510 nm處測OD值。用體積分數70%乙醇調零,Vc(0.01～0.07 mg/mL)為陽性對照。按公式(2)計算清除率：

(2)

式中：A1，樣品管吸光度；A2，樣品本底管吸光度；A0，空白對照管的吸光度。

將樣品稀釋成不同體積分數(10%～70%)的待測樣,取0.5 mL樣品溶液與1.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)混合，25 ℃水浴20 min，然后加入0.2 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，反應4 min，取濃鹽酸0.25 mL終止反應。于λ=325 nm處測OD值，記作Ak；以溶劑代替樣品，同樣條件反應測Aj，蒸餾水調零。Vc(0.1～0.7 mg/mL)為陽性對照。按公式(3)計算清除率：

(3)

式中：Ak，樣品管吸光度；Aj，空白對照管的吸光度。

1.3.5.4 總抗氧化能力

根據總抗氧化能力試劑盒說明書測定。

2 結果與分析

2.1 菠蘿酵素成分含量

菠蘿酵素化學成分如表1所示，4種化學成分中總糖含量最高，總酚次之，總黃酮的含量最低。在果蔬酵素中，糖含量的高低會影響酵素的口感和風味，是檢驗酵素優劣的指標之一[24]。乳酸菌和酵母菌作為常用發酵菌種，在糖代謝過程中扮演著重要的角色。在發酵前期，乳酸菌利用果實自身的糖和外源糖進行生理代謝活動，隨著酵母菌的添加，兩者共同的代謝活動使得整個發酵體系糖含量降低。經乳酸菌和酵母菌復合發酵4個月后獲得的核桃青皮酵素總糖，總酚，黃酮和蛋白質含量均比菠蘿酵素高[25]。后者發酵時間比前者長，這可能是造成總糖含量差異的原因之一。BRAVO等[26]研究表明總酚作為一種抗氧化劑，通過快速向自由基提供氫原子來干擾脂質和其他分子的氧化，從而達到清除自由基的目的，其中的黃酮類因特殊的化學結構而具有抗氧化能力。隨著發酵的進行，總酚含量也會發生變化，CHU等[27]研究發現，在發酵過程中，大分子酚類物質經微生物降解生成小分子酚類物質，使得總酚含量增加。而蛋白質含量的變化與微生物降解也有關系[28]。

表1 菠蘿酵素化學成分分析結果

2.2 功效酶活力

2.3 抗氧化能力

DPPH是一種很穩定的氮中心的自由基，在517 nm處有強吸收峰，通常被用來檢測物質的抗氧化性。IC50指自由基清除率為50%時對應的樣品濃度[33]，該值與物質的抗氧化能力呈反比關系。

表2 菠蘿酵素與其他酵素酶活性分析 單位：U/mL

注：“-”表示該文獻中未見報道

圖1和圖2分別為不同濃度的Vc和菠蘿酵素對DPPH自由基的清除能力。在實驗濃度范圍內，Vc對DPPH自由基清除率從45.61%上升到99.37%，菠蘿酵素對DPPH自由基清除率從36.04%上升到78.06%。經計算得，菠蘿酵素對DPPH自由基的IC50為7.30%。以Vc為陽性對照時，其半抑制量為0.011 mg Vc當量/mL。CHU等[27]研究表明，發酵物質對自由基清除率表現出差異受原料、微生物和發酵液代謝產物的影響。

圖1 不同濃度的Vc對DPPH自由基清除能力

圖2 不同濃度的菠蘿酵素對DPPH自由基清除能力

圖3和圖4分別為不同濃度的Vc和菠蘿酵素對·OH的清除能力。實驗濃度范圍內，Vc對·OH清除率從31.63%上升到51.14%，菠蘿酵素對·OH清除率從28.81%上升到63.21%。經計算得，菠蘿酵素對·OH的IC50為29.30%。以Vc為陽性對照時，其半抑制量為0.070 mg Vc當量/mL。CLAUDINE等[34]研究表明，黃酮類化合物對·OH有較好的清除能力，其清除能力的強弱取決于芳香環上羥基的數目和位置[35]。

圖3 不同濃度的Vc對·OH清除能力

圖4 不同濃度的菠蘿酵素對·OH清除能力

圖5 不同濃度的Vc對清除能力

圖6 不同濃度的菠蘿酵素對清除能力

菠蘿酵素的總抗氧化能力為(31.62±1.73)U/mL。JAYAPRAKASHA等[37]研究發現，酚類、類胡蘿卜素和黃酮類等化合物的協同作用可以提高物質的總抗氧化活性。另外，物質中的化學成分和酚酸含量與總抗氧化能力也有關系[35]。

在體外抗氧化能力實驗中發現，菠蘿酵素的抗氧化活性較好。這可能是因為，在發酵過程中，菠蘿本身含有抗氧化成分，如Vc等[2],另外，所選發酵菌種自身就具有很好的抗氧化能力[38]。除此之外，發酵過程中微生物使原料中的功能成分進行轉化和利用[27,38]，多種功能成分的協同作用使其總抗氧化活性增強[37]，但其具體的生理作用仍需進一步的研究。

3 結論