酵母菌-植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵菠蘿酵素生物活性的初步研究

趙治巧，曾莉，萬玉軍，王剛，唐自鐘*，布同良，陳惠，羅麗娟

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安,625014)2(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都,611130)

菠蘿，又稱鳳梨，為四大熱帶名果之一[1]，富含Vc、碳水化合物和有機(jī)酸(主要為奎寧酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸和檸檬酸等)等成分[2]，具有健胃消食、治療咽炎和促進(jìn)血液循環(huán)[3]的作用。它作為一種季節(jié)性強(qiáng)的水果，很難長(zhǎng)期保存[4]，除可供鮮食之外，對(duì)其進(jìn)行加工也是亟待解決的一個(gè)問題。

果蔬酵素是植物綜合酵素的一種，以一種或多種新鮮水果、蔬菜、蘑菇等純天然植物為原料[5]，經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的富含酚類、有機(jī)酸、氨基酸、黃酮類等營(yíng)養(yǎng)成分[6-7]和具有抗氧化、解酒護(hù)肝、改善腸胃狀況、凈化血液和潤(rùn)腸通便[8-9]以及其他功效的新型產(chǎn)品。其主要酶類有脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)[10]。在食品發(fā)酵中，酵母菌、乳酸菌和醋酸菌是常用的發(fā)酵菌種[11]。果蔬經(jīng)微生物作用后，在原有營(yíng)養(yǎng)功能的基礎(chǔ)上還會(huì)帶來別的功效[12]。目前，關(guān)于果蔬酵素，很多學(xué)者致力于它的抗氧化研究。李凡等[13]通過復(fù)合發(fā)酵獲得白首烏酵素對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力；樊秋元等[14]研究發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵的黑加侖酵素抗氧化能力比自然發(fā)酵的抗氧化能力強(qiáng)；此結(jié)果與人參酵素抗氧化活性研究結(jié)果一致[15]。菠蘿酵素為菠蘿經(jīng)酵母菌和植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵后獲得的發(fā)酵液，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究報(bào)告較為少見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和果酒酵母(fruit wine yeast)，四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院；菠蘿，市售；福林酚試劑、3,5-二硝基水楊酸、苯酚，北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化試劑盒、α-淀粉酶試劑盒、總超氧化物歧化酶試劑盒，南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25數(shù)顯pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；XZ18K-T高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；Multiskan Sky酶標(biāo)儀，上海合商科學(xué)儀器有限公司；其他均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菠蘿酵素的制作

制作工藝：選取新鮮菠蘿→去皮→切塊→裝瓶→加入酵母菌→補(bǔ)糖→加入乳酸菌→后熟→停止發(fā)酵→得發(fā)酵液。

1.3.2 樣品預(yù)處理

取發(fā)酵6個(gè)月的菠蘿酵素，經(jīng)8 000 r/min離心20 min，取上清液作為試驗(yàn)樣品備用。

1.3.3 菠蘿酵素化學(xué)成分含量的測(cè)定

總糖含量,參考文獻(xiàn)[5,16];總黃酮含量,參考文獻(xiàn)[17];總酚含量,參考文獻(xiàn)[5,18],蛋白質(zhì)含量,參考文獻(xiàn)[5,19]。

1.3.4 功效酶活力測(cè)定

樣品處理：樣品經(jīng)過20 min細(xì)胞破碎處理(破碎5 s、間歇5 s)，再低溫離心(8 000 r/min，15 min)，取上清液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

T-SOD活力測(cè)定，根據(jù)總超氧化物歧化酶活力測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行;蛋白酶活力測(cè)定，參考文獻(xiàn)[16]；淀粉酶活力測(cè)定，采用碘-淀粉比色法測(cè)定(試劑盒)；脂肪酶活力測(cè)定，參考文獻(xiàn)[20]。

1.3.5 抗氧化能力測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[21]，準(zhǔn)確配制0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，用蒸餾水稀釋樣品成不同體積分?jǐn)?shù)(4%～28%)的待測(cè)樣。在酶標(biāo)板上，加入100 μL DPPH溶液和100 μL梯度樣品溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，于λ=517 nm處測(cè)OD值。以無水乙醇作為空白對(duì)照，Vc(0.01～0.07 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。按公式(1)計(jì)算清除率：

(1)

式中：A1，樣品管吸光度；A2，樣品本底管的吸光度；A0，空白對(duì)照管的吸光度。

1.3.5.2 ·OH清除能力

參考文獻(xiàn)[21-22]，將樣品稀釋成不同體積分?jǐn)?shù)(8%～56%)的待測(cè)樣。取50 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 6 mmol/L H2O2溶液，200 μL酵素溶液，搖勻，靜止10 min，再加入50 μL 6 mmol/L水楊酸溶液，50 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，搖勻，37 ℃反應(yīng)30 min。于λ=510 nm處測(cè)OD值。用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇調(diào)零,Vc(0.01～0.07 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。按公式(2)計(jì)算清除率：

(2)

式中：A1，樣品管吸光度；A2，樣品本底管吸光度；A0，空白對(duì)照管的吸光度。

將樣品稀釋成不同體積分?jǐn)?shù)(10%～70%)的待測(cè)樣,取0.5 mL樣品溶液與1.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)混合，25 ℃水浴20 min，然后加入0.2 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，反應(yīng)4 min，取濃鹽酸0.25 mL終止反應(yīng)。于λ=325 nm處測(cè)OD值，記作Ak；以溶劑代替樣品，同樣條件反應(yīng)測(cè)Aj，蒸餾水調(diào)零。Vc(0.1～0.7 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。按公式(3)計(jì)算清除率：

(3)

式中：Ak，樣品管吸光度；Aj，空白對(duì)照管的吸光度。

1.3.5.4 總抗氧化能力

根據(jù)總抗氧化能力試劑盒說明書測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿酵素成分含量

菠蘿酵素化學(xué)成分如表1所示，4種化學(xué)成分中總糖含量最高，總酚次之，總黃酮的含量最低。在果蔬酵素中，糖含量的高低會(huì)影響酵素的口感和風(fēng)味，是檢驗(yàn)酵素優(yōu)劣的指標(biāo)之一[24]。乳酸菌和酵母菌作為常用發(fā)酵菌種，在糖代謝過程中扮演著重要的角色。在發(fā)酵前期，乳酸菌利用果實(shí)自身的糖和外源糖進(jìn)行生理代謝活動(dòng)，隨著酵母菌的添加，兩者共同的代謝活動(dòng)使得整個(gè)發(fā)酵體系糖含量降低。經(jīng)乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵4個(gè)月后獲得的核桃青皮酵素總糖，總酚，黃酮和蛋白質(zhì)含量均比菠蘿酵素高[25]。后者發(fā)酵時(shí)間比前者長(zhǎng)，這可能是造成總糖含量差異的原因之一。BRAVO等[26]研究表明總酚作為一種抗氧化劑，通過快速向自由基提供氫原子來干擾脂質(zhì)和其他分子的氧化，從而達(dá)到清除自由基的目的，其中的黃酮類因特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有抗氧化能力。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總酚含量也會(huì)發(fā)生變化，CHU等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中，大分子酚類物質(zhì)經(jīng)微生物降解生成小分子酚類物質(zhì)，使得總酚含量增加。而蛋白質(zhì)含量的變化與微生物降解也有關(guān)系[28]。

表1 菠蘿酵素化學(xué)成分分析結(jié)果

2.2 功效酶活力

2.3 抗氧化能力

DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，在517 nm處有強(qiáng)吸收峰，通常被用來檢測(cè)物質(zhì)的抗氧化性。IC50指自由基清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度[33]，該值與物質(zhì)的抗氧化能力呈反比關(guān)系。

表2 菠蘿酵素與其他酵素酶活性分析 單位：U/mL

注：“-”表示該文獻(xiàn)中未見報(bào)道

圖1和圖2分別為不同濃度的Vc和菠蘿酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Vc對(duì)DPPH自由基清除率從45.61%上升到99.37%，菠蘿酵素對(duì)DPPH自由基清除率從36.04%上升到78.06%。經(jīng)計(jì)算得，菠蘿酵素對(duì)DPPH自由基的IC50為7.30%。以Vc為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，其半抑制量為0.011 mg Vc當(dāng)量/mL。CHU等[27]研究表明，發(fā)酵物質(zhì)對(duì)自由基清除率表現(xiàn)出差異受原料、微生物和發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的影響。

圖1 不同濃度的Vc對(duì)DPPH自由基清除能力

圖2 不同濃度的菠蘿酵素對(duì)DPPH自由基清除能力

圖3和圖4分別為不同濃度的Vc和菠蘿酵素對(duì)·OH的清除能力。實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Vc對(duì)·OH清除率從31.63%上升到51.14%，菠蘿酵素對(duì)·OH清除率從28.81%上升到63.21%。經(jīng)計(jì)算得，菠蘿酵素對(duì)·OH的IC50為29.30%。以Vc為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，其半抑制量為0.070 mg Vc當(dāng)量/mL。CLAUDINE等[34]研究表明，黃酮類化合物對(duì)·OH有較好的清除能力，其清除能力的強(qiáng)弱取決于芳香環(huán)上羥基的數(shù)目和位置[35]。

圖3 不同濃度的Vc對(duì)·OH清除能力

圖4 不同濃度的菠蘿酵素對(duì)·OH清除能力

圖5 不同濃度的Vc對(duì)清除能力

圖6 不同濃度的菠蘿酵素對(duì)清除能力

菠蘿酵素的總抗氧化能力為(31.62±1.73)U/mL。JAYAPRAKASHA等[37]研究發(fā)現(xiàn)，酚類、類胡蘿卜素和黃酮類等化合物的協(xié)同作用可以提高物質(zhì)的總抗氧化活性。另外，物質(zhì)中的化學(xué)成分和酚酸含量與總抗氧化能力也有關(guān)系[35]。

在體外抗氧化能力實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，菠蘿酵素的抗氧化活性較好。這可能是因?yàn)椋诎l(fā)酵過程中，菠蘿本身含有抗氧化成分，如Vc等[2],另外，所選發(fā)酵菌種自身就具有很好的抗氧化能力[38]。除此之外，發(fā)酵過程中微生物使原料中的功能成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化和利用[27,38]，多種功能成分的協(xié)同作用使其總抗氧化活性增強(qiáng)[37]，但其具體的生理作用仍需進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論