高產橙黃色素低產桔霉素紅曲菌的液態發酵條件優化

周珂，嚴鵬程，胡永丹*

1(昆明理工大學 農業與食品學院，云南 昆明，650500) 2(昆明理工大學 云南省食品安全研究院，云南 昆明,650500)

紅曲色素是紅曲菌代謝過程中形成的聚酮類化合物[1]，主要有黃、橙、紅3種色調[2]，具有抗氧化[3]、抗肥胖[4]、增強免疫力、調節血脂[5]以及抑制阿爾茨海默病[6]的功效，在食品、釀酒、保健品等行業均有廣泛應用。其中紅色素的生產工藝已十分成熟，而橙、黃色素因其良好的感官性能，來源天然以及不受季節、地域性限制等優點，具有良好的發展潛力和經濟潛能，因此成為天然色素產品開發的新方向。

然而在紅曲菌的發酵過程中，桔霉素常常伴隨紅曲色素的合成而產生。桔霉素有損害肝臟代謝、致畸[7]、致癌和致突變的作用[8]，并可能對中樞神經系統產生抑制[9]，這使得紅曲產品的食用安全性受到挑戰，限制了它的應用。目前，降低桔霉素含量主要是通過篩選菌株、基因工程及控制發酵條件3種方法[10]。已有學者通過菌株篩選獲得了低產桔霉素的紅曲菌株[11]。此外，通過優化發酵條件也能夠控制紅曲的生長情況[12]，以及利用低頻磁場能夠抑制桔霉素的產生[13]。本研究通過改變紅曲菌液態發酵條件(如培養基成分、培養條件)，研究紅曲色素和桔霉素在紅曲菌中的積累規律[14]，通過外部調控選擇安全有效的培養方式，為紅曲色素的安全應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

紅曲菌株(MonascuspurpureusZH2)，由江南大學固態發酵研究室提供。

1.1.2 試劑

葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4,國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿干粉、酵母膏,南京茂捷微生物科技有限公司；馬鈴薯、大米粉、糯米粉,市售；桔霉素(標準品),上海源葉生物科技有限公司產品；甲醇、磷酸,天津風船化學試劑科技有限公司；乙腈,上海星可高純溶劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

RXZ-288A人工氣候箱，寧波江南儀器廠；LS-30立式壓力蒸汽滅菌器，上海東亞壓力容器制造有限公司；QYC-2102全溫培養搖床，寧波市科技園區新江南儀器有限公司；T9CS雙光束紫外可見光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基與培養條件

將紅曲菌接種于PDA斜面，放置于28 ℃恒溫培養箱中靜置培養7 d，4 ℃保藏。

制備孢子懸浮液：用無菌水洗下PDA斜面上的紅曲菌孢子，然后用玻璃珠將菌團打散后過濾，血球計數板計數，使孢子數達到1×(107～108)個/mL。

種子培養基(g/L)：葡萄糖60，大豆水解液60，蛋白胨10，NaNO31.0，MgSO4·7H2O 2.0，KH2PO45.0，ZnSO40.02，pH自然。在28 ℃、180 r/min的條件下培養48 h。

初始發酵培養基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨10，NaNO33.0，初始pH自然。

所有培養基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 不同碳源對紅曲菌生長的影響

采用葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、大米粉、糯米粉，分別設置40、50、60 g/L三個梯度，氮源統一為蛋白胨，無機鹽為KH2PO4和K2HPO4，pH自然。250 mL三角瓶裝液50 mL，經121 ℃滅菌20 min，接種10%種子培養基，每組樣品做3個平行，在28 ℃，180 r/min下振蕩培養5 d。

1.2.2.2 不同氮源對紅曲菌生長的影響

可溶性淀粉作為碳源，添加量為60 g/L，(NH4)2SO4、NH4Cl、蛋白胨、玉米漿干粉、酵母膏、NaNO3為氮源，分別設置10、20、30 g/L 3個梯度，無機鹽及培養條件同上。

1.2.2.3 不同無機鹽對紅曲菌生長的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，向發酵培養基中分別添加KH2PO4、K2HPO4、MgSO4(1.0、2.0、3.0 g /L)、ZnSO4(0.05、0.1、0.15 g/L)、MnSO4(0.1、0.2、0.3 g /L)。培養條件同上。

1.2.2.4 復合添加無機鹽對紅曲菌生長的影響

以添加K2HPO4的發酵培養基為對照，在此基礎上分別將MgSO4、MnSO4、ZnSO4設計成不同的添加組合，各種無機鹽的添加量與1.2.2.3優化出的單因素添加量一致。培養條件同上。

1.2.2.5 不同溫度對紅曲菌生長的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，將接種好的搖瓶分別放置在18、23、28、33 ℃的條件下培養5 d。

1.2.2.6 不同裝液量對紅曲菌生長的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，分別向250 mL錐形瓶中添加50、60、70、80、90、100、110、120 mL發酵培養基，在28 ℃條件下培養5 d。

1.2.2.7 不同pH對紅曲菌生長的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，裝液量為50 mL/250 mL，初始pH用HCl和NaOH調至2、3、4、5、6、7、8，在28 ℃條件下培養5 d。

1.2.2.8 不同轉速對紅曲菌生長的影響

可溶性淀粉添加量為60 g/L，(NH4)2SO4添加量為10 g/L，K2HPO4添加量為2 g/L，接種量為8%，裝液量為50 mL/250 mL，初始pH為3，將搖床轉速分別設置為160、180、200、220 r/min，在28 ℃條件下培養5 d。

1.3 測定方法

1.3.1 測定色價

將發酵液研磨破碎后取1 mL于25 mL比色管中，用體積分數為70%的乙醇定容至25 mL，顛倒混勻，置于60 ℃恒溫水浴中浸提40 min。浸提結束后，取出冷卻至室溫，用乙醇稀釋適當倍數，并以70%乙醇為空白對照，在全波長掃描下找出橙、黃色素的最大吸收峰，得到黃、橙色素的OD值。通過公式(1)、(2)計算色價：

黃色價/(U·mL-1)=OD410×總稀釋倍數

(1)

橙色價/(U·mL-1)=OD470×總稀釋倍數

(2)

1.3.2 測定菌體干重

將濾紙烘干至恒重，精確稱量濾紙的質量。充分混合后精確量取30 mL發酵液進行抽濾，濾渣用蒸餾水充分洗滌數遍后，55 ℃烘干至恒重，精確稱量濾渣及濾紙的總質量。

1.3.3 桔霉素含量測定

將發酵液經破碎后取5 mL置于15 mL比色管中，并用同體積的甲醇定容至10 mL，超聲萃取30 min后于8 000 r/min下離心10 min，然后將提取液微濾后用HPLC分析檢測桔霉素含量。

HPLC色譜條件：流動相，V(0.1%磷酸水)∶V(乙腈)=66∶34；VWD檢測器λ=330 nm；色譜柱5 μm，Agilent XDB Reversed-phase C18；柱長及柱徑250 mm×4.6 mm；體積流量1.0 mL/min；溫度30 ℃；標準樣及樣品進樣量均為20 μL。

1.4 數據統計分析

顯著性差異分析使用非參數秩和檢驗的方法(IBM SPSS Statistics 20，NY，USA)。數據作圖使用Origin 8.5(Originlab corporation，Inc.MA，USA)。

2 結果與分析

2.1 300～600 nm內的波長掃描

按照1.3.1方法對發酵提取液進行可見光波長范圍內掃描，確定橙、黃色素所在的波長范圍，結果如圖1所示。可以看出，在410 nm和470 nm附近有明顯的吸收峰，分別為黃色素和橙色素。

圖1 紅曲菌液態發酵色素提取液的光譜掃描圖

2.2 碳源對紅曲菌生長的影響

由表1可知，葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉促進紅曲菌ZH2色素生長的效果相對明顯。可溶性淀粉作為碳源時，紅曲菌在代謝過程中產生淀粉酶和糖化酶將淀粉緩慢分解，從而使發酵液中的單糖濃度維持在一定水平，不會造成菌體快速地大量生長，有利于紅曲色素的產生和積累。而高濃度的葡萄糖作為碳源時，會產生乙醇，從而抑制菌體的生長和色素的合成[15]。當蔗糖作為碳源時，菌體成大塊團狀，與培養基接觸面積過小，導致菌體缺乏營養，不利于色素的積累。麥芽糖和葡萄糖為碳源時，桔霉素質量濃度最高達到7.15、8.35 μg/mL，可溶性淀粉質量濃度為60 g/L時，桔霉素含量最低，為5.91 μg/mL，所以選擇60 g/L可溶性淀粉為紅曲菌ZH2發酵的碳源。

2.3 氮源對紅曲菌生長的影響

以60 g/L可溶性淀粉作為碳源，分析氮源對紅曲菌生長的影響。由表2可知，不同種類及濃度的氮源對紅曲菌ZH2的橙黃色素產量、菌絲干重、桔霉素的含量影響差異較大，表現出無機氮源整體優于有機氮源。(NH4)2SO4等無機氮源更適合橙黃色素生長，這可能是因為銨鹽作為氮源被消耗時，降低了發酵液pH值，使發酵體系處于酸性環境中，影響相關代謝酶活性，抑制桔霉素生成或加速其作為中間代謝產物的分解，促進紅曲黃色素生物合成[16]。

表1 不同碳源對紅曲菌ZH2生長的影響

注：大寫字母、小寫a、a1、a2等字母分別代表各種類間黃色價、橙色價、菌絲干重、桔霉素含量的顯著性差異(P<0.05)(下同)

表2 不同氮源對紅曲菌ZH2生長的影響

當有機氮源作為紅曲菌的氮源時，會被紅曲菌在代謝過程中產生的蛋白酶分解成多種氨基酸，從而與紅曲橙色素發生反應，將橙色素轉變成水溶性紅色素。而無機氮源中不含氨基酸類物質，所以不會出現上述現象。當(NH4)2SO4質量濃度為10 g/L時，黃色素含量最高，菌體生長狀況良好，且桔霉素含量為7.011 μg/mL，處于較低水平。結合顯著性差異分析，選擇(NH4)2SO410 g/L作為紅曲菌ZH2發酵的最佳氮源及添加量。通過氮源的優化選擇，發酵液由之前的棕紅色變成了明顯的橙黃色。

2.4 外加無機鹽對紅曲菌生長的影響

以可溶性淀粉及(NH4)2SO4作為發酵培養基的碳、氮源，添加不同的無機鹽到發酵培養基中，產生的色素色價各有不同，其中 KH2PO4和K2HPO4比其他幾種無機鹽發酵產生的橙、黃色素優勢明顯，這是因為KH2PO4和K2HPO4能夠作為培養基的緩沖體系，維持并穩定培養基在紅曲菌代謝過程中的pH。由表3可知，添加K2HPO4比KH2PO4產生的桔霉素含量要少，在質量濃度為2.0 g/L時，橙、黃色價分別達到113.51 U/mL，79.63 U/mL，桔霉素含量為6.82 μg/mL。從原材料的來源及貯存等方面考慮，選用K2HPO4為紅曲菌ZH2發酵的無機鹽。

磷酸鹽在微生物生長和代謝調節中，具有重要的生理功能，但在合成產物的過程中還需要一些無機離子的參與[17]。以添加K2HPO4的發酵培養基為對照，在此基礎上分別添加MgSO4、MnSO4、ZnSO4、MnSO4+ZnSO4、MgSO4+ZnSO4、MgSO4+MnSO4、MgSO4+MnSO4+ZnSO4等不同無機鹽組合，考察復合無機鹽對紅曲生長的影響。由表3可知，添加了2 g/L的MgSO4和0.02 g/L的ZnSO4組合生產色素的能力最高，橙、黃色素色價分別達到119.28 U/mL，94.38 U/mL，相對應的桔霉素含量為7.10 μg/mL。綜上所述，將2.0 g/L K2HPO4、2.0 g/L MgSO4及0.02 g/L ZnSO4作為紅曲菌ZH2的外加無機鹽。

表3 不同無機鹽對紅曲菌ZH2生長的影響

注：后7組中無機鹽的添加量(g/L)分別為MgSO42；MnSO40.04；ZnSO40.02；MnSO40.04+ZnSO40.02；MgSO42+ZnSO40.02；MgSO42+MnSO40.04；MgSO42+MnSO40.04+ZnSO40.02

2.5 溫度對紅曲菌生長的影響

由圖2可知，在18～28 ℃的溫度范圍下，隨著溫度升高，橙、黃色素色價升高。當培養溫度為28 ℃時，發酵液的色價最大，橙、黃色素色價分別為59.06 U/mL，38.56 U/mL；溫度超過30 ℃，發酵液的色價明顯降低，原因可能是因為溫度對微生物細胞生長、產物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變培養基的性質，而且會影響細胞代謝過程中各種關鍵酶的活性[18]。過高或過低的溫度，不利于菌體的生長和色素的積累，從桔霉素含量可以看出，在28 ℃下桔霉素含量最低，達到5.70 μg/mL，故選擇28 ℃為培養的最適溫度。

圖2 溫度對紅曲菌生長的影響

2.6 裝液量對紅曲菌生長的影響

從圖3可以看出，隨著裝液量的增加，橙、黃色素產量逐漸降低，菌絲干重逐漸減少，說明裝液量越大，越不利于紅曲菌的生長[19]。這是因為紅曲菌是好氧菌，在營養充足的情況下，裝液量越少其通氣量越大，溶氧量越多，有利于菌體生長以及產生色素等代謝產物。同時裝液量不同，桔霉素的含量差別較大，在50～100 mL時，桔霉素逐漸增加，直到裝液量為110 mL時，桔霉素含量隨有所降低，但仍高于50 mL時的桔霉素含量。裝液量為50 mL時，橙、黃色素分別達到85.50 U/mL，83.63 U/mL，菌絲干重更多，說明該條件下更有利于菌體的生長，對應的桔霉素含量最低，僅為5.73 μg/mL，故選擇50 mL為最佳裝液量。

2.7 不同pH對紅曲菌生長的影響

由圖4可知，中性環境促進紅曲菌產色素的能力不夠突出；中性偏酸環境有利于紅曲菌產色素，菌體得率也較高，過酸環境既不利于菌體的生長也不利于色素的生成；在堿性環境下菌體基本不生長，色價也很低[20]。綜上，過酸或堿性環境都不利于色素的生長積累，當pH 3～4時，菌體生長良好，總色價較高，發酵液顏色較深，其中pH 3的效果最好，紅曲菌產色素的最適pH應該最接近3[21]。pH為3時，橙、黃色素含量分別達到75.63 U/mL，107.00 U/mL，而且其相對應的桔霉素含量為6.43 μg/mL，低于產色素能力相近的pH 4所對應的桔霉素含量8.27 μg/mL，所以選擇pH 3作為紅曲菌ZH2發酵的初始pH。

圖4 不同pH對紅曲菌ZH2產紅曲色素的影響

2.8 不同轉速對紅曲菌生長的影響

由圖5可知，隨著轉速的增加，橙、黃色素色價逐漸增大，在200～220 r/min時達到穩定狀態。轉速越大，通氣量越大，紅曲菌的溶氧就越大，從而越有利于菌體生長，但是轉速過大，雖能增加溶氧量，但會因剪切力過大，對菌絲的生長產生影響，從而導致色素的生長能力降低[19]。由圖5看出，在200 r/min和220 r/min條件下的色素產量相當，但后者的菌體生長量達到最大，且桔霉素含量低于200 r/min時，所以選擇220 r/min作為培養的最佳轉速。在此條件下，紅曲菌ZH2的橙、黃色素色價分別達到152.96、108.38 U/mL，桔霉素含量為5.80 μg/mL。

圖5 不同轉速對紅曲菌ZH2生長的影響

3 結論

通過對紅曲菌ZH2進行單因素優化實驗，得到了在搖床水平下發酵紅曲菌ZH2高產紅曲色素、低產桔霉素的最佳培養基配方：碳源為可溶性淀粉60 g/L，氮源為(NH4)2SO410 g/L，無機鹽K2PO42.0 g/L，MgSO42.0 g/L，ZnSO40.02 g/L；最適的發酵條件為溫度28 ℃，裝液量50 mL/250 mL，初始pH 3，轉速220 r/min，發酵5 d。經過優化后，發酵液中橙、黃色素由最初的18.59 U/mL，24.54 U/mL分別提高到152.96 U/mL，108.38 U/mL，桔霉素含量由最初的8.35 μg/mL減少到5.80 μg/mL，降低了30%。