短時熱處理對低溫逆境下黃瓜不同部位的冷害及活性氧代謝影響

趙昱瑄，張敏,2,3*，姜雪，胡均如，李佳樂，蓋曉陽

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海，201306)

黃瓜(CucumissativusLinn.)作為日常生活中最常見的果蔬之一，自身水分含量達98%，含有豐富的維生素、胡蘿卜素等營養成分[1]。在常溫下貯藏，黃瓜的營養物質快速流失，黃瓜容易衰老并發生腐敗;而適合的貯藏溫度雖然能夠減緩衰老[2]，防止營養物質的損失，但黃瓜在低溫貯藏下會發生細胞膜的破壞，進而發生冷害[3]。黃瓜果實冷害的發生受到諸多因素的共同影響[4]，冷害對果實品質影響很大，在表面形成黑斑，隨著貯藏時間的延長，果實耐貯性逐漸下降，冷害面積逐漸增大，冷害程度加深，嚴重影響商品價值。故對黃瓜果實進行冷藏的同時，還需采取一定的措施來減輕冷害的發生。熱處理能延長水果貨架期，抑制生理病害，還能提高果蔬的抗冷性，減輕冷害，并且在食用方面有一定的安全性[5]。SHAO等[6]用45 ℃熱空氣處理枇杷果實3 h，顯著降低了枇杷的冷害發生率。李秀杰等[7]發現8 ℃熱水處理 10 min 的‘魯星’油桃可以減輕果肉褐變和腐爛，保持油桃風味。喬勇進等[8]通過對黃瓜進行37 ℃熱空氣處理24 h，維持了細胞膜的完整性，減輕了低溫傷害，延緩了冷害的發生。IBRAHIM等[9]發現55 ℃熱水處理可提高黃瓜果實CAT、APX和POD的活性，降低果實的冷害發生率。熱處理同樣也能提高柑橘[10]、西葫蘆[11]、青椒[12]的抗冷性。黃瓜果實與果梗連接處含有一定量的苦味素也叫葫蘆素C，有抗腫瘤的功能[13]，具有一定的研究價值。目前，國內外學者在熱處理技術減輕果蔬冷害方面進行了大量的研究，但都限于對黃瓜果實單一部位的影響，而對果實不同部位的冷害和活性氧代謝的研究較少見報道。

本研究以黃瓜為試驗材料，根據前期的二次正交旋轉組合設計試驗選出的4 ℃貯藏溫度下最佳熱處理條件(39.4 ℃熱水中熱激24.4 min)，測定黃瓜果實活性氧清除酶的活性以及膜脂含量對低溫脅迫的變化,研究了短時熱處理對低溫逆境下黃瓜不同部位的冷害研究,為進一步研究熱處理對貯藏保鮮與耐冷性的關系，并應用于黃瓜的貯藏保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 試劑與儀器

NaOH、抗壞血酸、H2O2、硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二鈉、甲硫氨酸、核黃素、三氯乙酸、無水乙醇、磷酸氫鈉、冰醋酸,國藥集團化學試劑有限公司；MDA測試盒、H2O2測試盒、超氧陰離子自由基測試盒、超氧化物歧化酶測試盒，南京建成生物工程研究所。

BPS-100CA 型恒溫恒濕培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；HSWX-600BS 型電熱恒溫水溫箱，上海圣科儀器設備有限公司；H-2050R-1型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；THZ-82A 型恒溫振蕩箱，江蘇省金壇市環宇科學儀器廠；GY-4型數顯果實硬度計，浙江托普云農科技股份有限公司；BJ2100D型數字孔式電子天平；DDS-307 型電導率儀，上海笛柏實驗設備有限公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 冷害指數的測定

分別隨機取15根黃瓜，觀察冷害狀況，判斷冷害等級[14]。冷害指數共分為5個等級，即0級，無冷害；1級，冷害面積小于25%；2級，冷害面積為25%～50%，輕度冷害；3級，冷害面積為50%～75%，中度冷害；4級，冷害面積為75%～100%，嚴重冷害。按照公式(1)計算冷害指數，重復3次。

(1)

1.3.2 硬度的測定

硬度測定參考曹建康等[14]的方法，在黃瓜果實頭部(花萼端)、赤道部位、尾部(果梗端)取1 cm厚果肉，將硬度計垂直打入黃瓜果實果肉處測定。

1.3.3 EL、MDA含量的測定

EL的測定參考曹建康等[14]的方法進行修改。黃瓜切成薄片，用打孔器取圓片，加20 mL去離子水，振蕩后過濾，再加入離子水，測定初始電導率(R0)。真空干燥后放入振蕩箱振蕩，測定樣品溶液電導率(R)。煮沸取出后冷卻，測定溶液的電導率(R′)。按照公式(2)計算電解質外滲百分率(Y)：

(2)

MDA含量采用MDA測試盒測定。

1.3.4 PPO活性的測定

參考曹建康等[14]的方法。PPO催化后形成產物在420 nm處有最大光吸收峰，可利用比色法測定。

1.3.5 可溶性蛋白含量的測定

采用紫外吸收法[14]測定。在280 nm處其吸光度值蛋白質出現吸收高峰，其吸光度值與蛋白質含量成正比。

1.3.6 CAT、POD、APX、SOD的活性測定

CAT、APX活性測定參考CHEN等[15]的方法；CAT以每克果肉1 min內OD240值變化0.01為1個酶活單位；APX以每克果肉1 min內OD290值變化0.01為1個酶活單位；POD含量參考曹建康等[14]的方法，采用愈創木酚法進行測定；超氧化物歧化酶含量的測定采用SOD測試盒測定。

1.3.7 H2O2含量和超氧陰離子自由基的測定

1.4 數據分析

所有試驗數據進行3次重復，SPSS軟件進行單因素方差分析，Duncan法進行多重比較，數據采用Excel 2010軟件處理。

2 結果與分析

2.1 短時熱處理對黃瓜果實不同部位冷害指數的影響

冷害指數是能直觀地判斷冷害發生程度的指標[16]。如圖1所示，黃瓜在4 ℃貯藏條件下，CK組和HWT組的冷害指數隨貯藏時間的延長逐漸增加。在貯藏初期，黃瓜果實冷害癥狀不明顯，3 d后，HWT組和CK組黃瓜的頭部和中部均發生冷害，靠近頭部最嚴重，而尾部的冷害則推遲到第6天出現，之后冷害指數急劇上升，到第12天時CK組的頭部和中部的冷害指數達到0.6以上，HWT組的頭部和中部的冷害指數均低于對照組，HWT組尾部的冷害指數最低，僅為0.32，貯藏結束時CK組以及HWT組頭部、中部和尾部的冷害指數分別達到了0.84、0.85、0.62、0.79、0.80和0.55。黃瓜果實頭部、中部到尾部冷害指數逐漸上升，且存在顯著差異(P<0.05)。由此可見，黃瓜不同部位抑制冷害的效果不同，實驗結果表明整個低溫貯藏期，熱處理可以減輕貯藏過程中冷害的發生時間，且HWT組的頭部和中部的冷害要高于HWT組的尾部。王靜等[17]研究發現哈密瓜果實經過55 ℃熱水處理3 min，推遲了冷害的發生時間，使細胞膜破壞程度減輕，與本試驗結果一致。

圖1 短時熱處理對黃瓜果實不同部位冷害指數的影響

2.2 短時熱處理對黃瓜果實不同部位硬度的影響

黃瓜果實硬度是衡量其貯藏壽命的重要指標之一。如圖2所示，CK組和HWT組的硬度均呈現下降的趨勢，且隨著貯藏時間的延長，其降幅存在一定的差異。黃瓜果實貯藏3 d時，HWT組頭部、中部和尾部的黃瓜果實硬度分別比CK組的頭部、中部和尾部高1.56%、2.21%和2.34%。貯藏9 d后，HWT組的頭部、中部、尾部的硬度較0 d分別低12.34%、11.32%、9.96%，對照組的頭部、中部和尾部較0 d低15.79%、14.55%、10.54%。貯藏后期，隨著冷害的加重，CK組黃瓜果實中部的硬度降幅逐漸升高，說明冷害程度加速硬度的下降，下降的原因可能是冷害的加深，導致細胞軟化程度加深。從圖2可以看出，熱處理能較好地維持果實較高的硬度，且不同部位的黃瓜果實硬度存在顯著差異(P<0.05)，隨著貯藏時間的延長，頭部和中部的下降幅度增大。HWT組黃瓜果實的頭部、中部和尾部的硬度分別高于CK組頭部、中部、尾部的硬度，說明不同部位的黃瓜果實在低溫逆境下抑制硬度下降程度不同，而尾部的硬度比頭部和中部高，說明黃瓜果實尾部能更好地抑制軟化程度的加深。

圖2 短時熱處理對黃瓜果實不同部位硬度的影響

2.3 短時熱處理對黃瓜果實不同部位電解質外滲率和丙二醛含量的影響

黃瓜果實在低溫貯藏后細胞膜發生破壞，導致果實冷害的發生[18]。邵婷婷等[19]利用50 ℃強制對流熱空氣處理20 min能夠推遲青椒果實冷害發生的時間，能有效減輕低溫脅迫下活性氧的傷害，延緩了青椒果實冷害的發生。如圖3所示，CK組和HWT組的電解質外滲率(EL)均呈現增加的趨勢，且隨著貯藏時間的增加而增加。在4 ℃下貯藏9 d后，HWT組的頭部、中部、尾部的電解質外滲率分別為59.6%、56.2%、53.26%，較CK組的頭部、中部和尾部低6.88%、7.62%、6.51%。說明熱處理可以使黃瓜果實在低溫逆境下產生抗性，進而保護細胞的膜脂狀態，而尾部的電解質外滲率值比頭部和中部低，說明黃瓜果實尾部的抗冷性更強。

圖3 短時熱處理對黃瓜果實不同部位電解質外滲率(EL)的影響

丙二醛含量的變化跟電解質外滲率一樣均表征細胞膜的破壞情況，細胞膜上的磷脂分子被氧化，生成過氧化產物丙二醛稱之為膜脂過氧化現象，丙二醛的累積會破壞細胞膜的完整性[20]。ENDO等[21]通過青梅果實在45 ℃水中浸泡5 min,抑制了丙二醛和過氧化氫的升高，延緩了抗壞血酸含量和總抗氧化能力水平的下降，顯著降低果實對CI的敏感性。如圖4所示，在第3天，MDA含量有下降的趨勢，尾部下降較為明顯；6 d后，各組的黃瓜MDA含量增加迅速；貯藏前9 d,CK組尾部的MDA含量低于HWT組的中部和頭部，與貯藏前期冷害程度較低有關；至貯藏末期，對照組的頭部MDA含量的增長率最高，HWT組的尾部增長率最小；在貯藏結束時，其數值由貯藏初期的3.45 nmol/g升至7.36 nmol/g，顯著小于其他處理組(P<0.05)，說明熱處理能夠減輕細胞膜的破壞，從而減輕冷害，而熱處理組尾部的細胞膜破壞程度最低。

圖4 短時熱處理對黃瓜果實不同部位丙二醛含量的影響

2.4 短時熱處理對黃瓜果實不同部位可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白作為果實組織中的營養物質，也是重要的滲透調節物質，對生物膜和細胞起到保護作用[22]。從圖5可以看出，貯藏過程中，黃瓜果實可溶性蛋白含量呈現出先急劇上升后緩慢下降的趨勢。貯藏前3 d，可溶性蛋白含量明顯上升，可能與冷敏果實受到低溫脅迫機體自身合成一些小分子蛋白有關，接著可溶性蛋白質含量逐漸下降，可能是與低溫引起的蛋白質合成酶系統遭到破壞有關[23]。貯藏3 d后，可溶性蛋白含量逐漸下降，各組之間差異顯著(P<0.05)。HWT組尾部的可溶性蛋白含量由3 d時的0.70 mg/g下降至15 d時的0.49 mg/g，下降了42.86%。HWT組尾部的可溶性蛋白含量一直高于其他處理組，這可能是因為果蔬在遭受低溫逆境脅迫時，能合成小分子物質，以增強其抗逆性。

圖5 短時熱處理對黃瓜果實不同部位可溶性蛋白含量的影響

2.5 短時熱處理對黃瓜果實不同部位多酚氧化酶活力的影響

在果蔬貯藏過程中，多酚氧化酶參與一系列由酶促活動而引起的化學變化，多酚氧化酶使酚類物質氧化，引起果實組織褐變[24]。如圖6所示，貯藏過程中，PPO活力呈現上升的趨勢。貯藏初期PPO的活力上升，但各組之間數值差別不大，至6 d時，多酚氧化酶活力變化出現差異，黃瓜果實的尾部增長率最高達到8.03 U/g;至9 d時，多酚氧化酶活力再次上升，CK組尾部達到13.71 U/g，上升速度快、幅度大，隨著貯藏時間的延長，多酚氧化酶活力持續上升;15 d時CK組尾部比HWT組尾部高2.1(U/g)。在貯藏過程中，HWT組頭部的PPO活力相對最低，而CK組尾部的PPO活力在各組中相對最高.貯藏9 d后,HWT組尾部的PPO活力高于CK組的頭部和中部，與果實組織的成熟度有關，黃瓜果實尾部的成熟度大于頭部和中部。

圖6 短時熱處理對黃瓜果實不同部位多酚氧化酶(PPO)活力的影響

2.6 短時熱處理對黃瓜果實不同部位CAT、POD和APX、SOD酶活力的影響

在反應過程中，CAT能催化H2O2形成H2O[25]，能夠有效地清除自由基，從而維持膜的穩定性，減輕機體不良反應,如圖7所示。

圖7 短時熱處理對黃瓜果實不同部位過氧化氫酶(CAT)活力的影響

CAT酶活力呈現出先增大后減小的趨勢，貯藏第9天時各處理組的CAT活力均達到峰值，隨后逐漸降低。HWT組的頭部和中部的CAT活力大于CK組的頭部和中部;CK組的頭、中、尾部較0 d的高1.74倍、2.05倍和2.27倍，HWT組的頭、中、尾部較0 d的高1.92倍、2.22倍和2.46倍，表明果實中CAT活力在熱處理時被誘導升高，經過熱處理后黃瓜果實的活性氧較低，清除部分活性氧，細胞受傷害程度減小，從而抑制了冷害的發生，而且HWT組和CK組尾部的CAT活力都較高，說明尾部的CAT活力對于催化植物體內的H2O2分解為水和氧分子，從而減少H2O2對果蔬組織可能造成的氧化傷害的作用更顯著。

圖8 短時熱處理對黃瓜果實不同部位過氧化物酶(POD)活力的影響

抗壞血酸過氧化物酶(APX)能催化抗壞血酸與H2O2發生反應，清除果實內H2O2，進而提高果蔬的抗氧化能力[27]。如圖9所示，隨貯藏時間的延長，各處理組的APX活力均呈現先上升后下降的趨勢；HWT組的APX活力在貯藏第6天達到最大值，頭、中、尾部的值分別為111.13、112.88、123.25 U/g，比0 d高3.72、3.76、和4.9倍，隨后迅速下降。CK組APX活力在貯藏第9天達到最大值，頭、中、尾部的值為87.88、88.38、91.13 U/g。上述結果表明，熱處理可以保持細胞較高的活性氧清除酶活力，從而減少活性氧的積累，且HWT組尾部的活性氧清除酶活力最高。

圖9 短時熱處理對黃瓜果實不同部位抗壞血酸過氧化物酶(APX)活力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)可催化超氧陰離子自由基歧化生成H2O2和O2，前者分解為無毒的H2O和O2，也能夠保護細胞膜的完整性[28]。如圖10所示，隨貯藏時間的延長，各處理組的SOD活力均呈現先上升后下降的趨勢,HWT組的增長趨勢明顯。在貯藏第3天，SOD活力增長差別較小，HWT組的頭部、中部小于CK組的尾部，是由于貯藏前期冷害不明顯，尾部的抗冷性更強；各組SOD活力在貯藏第6天達到峰值，HWT組頭、中、尾部的值分別比CK組高36.37%、34.05%、30.76%。上述結果表明，熱處理可以有效提高果實的SOD酶活力，增強了清除自由基的能力；HWT組的尾部增長率高，說明尾部的自我保護能力更高。

圖10 短時熱處理對黃瓜果實不同部位超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

2.7 短時熱處理對黃瓜果實不同部位H2O2含量和超氧陰離子自由基的影響

H2O2是植物體內一種活性氧自由基，當活性氧清除系統代謝不平衡時，H2O2將會大量累積導致細胞膜結構受到破壞。由圖11可知，在貯藏期間(黃瓜H2O2含量總體呈上升的趨勢)，可對黃瓜果實細胞組織造成損傷。在貯藏初期，各組H2O2含量的頭部和中部無顯著性差異。在貯藏后期，CK組的H2O2含量顯著大于HWT組，第12天，CK組頭部、中部和尾部的H2O2含量分別比HWT組的頭部、中部和尾部高出26.7%、35.6%及38.1%。貯藏15 d，果實CK組頭部、中部、尾部的H2O2含量比0 d高4.8、4.7和4.6倍；HWT組頭部、中部和尾部的黃瓜果實的H2O2含量比0 d高3.9、3.8和3.7倍，表明熱處理在貯藏期能明顯抑制黃瓜果實體內H2O2含量上升，尾部的抑制效果更明顯。

圖11 短時熱處理對黃瓜果實不同部位H2O2含量的影響

圖12 短時熱處理對黃瓜果實不同部位的影響

3 結論

熱水處理能抑制黃瓜果實丙二醛含量以及電解質外滲率的升高，能提高APX、CAT、POD活力，提高黃瓜果實的抗氧化能力和活性氧清除能力。趙宇瑛等[34]為了研究黃瓜果實采后的耐冷性,在2 ℃下貯藏9 d后,分別測定頭部(花萼端)、中部、尾部(果梗端)3個部位的指標，黃瓜果實從尾部到頭部的耐低溫能力逐漸降低。本試驗熱處理組的頭、中、尾部與對照組相比，冷害指數、電導率、MDA含量要低于對照組，熱處理組的頭、中、尾部硬度分別高于對照組的頭、中、尾部，POD、CAT活力要高于對照組，這說明黃瓜果實不同部位熱處理均減輕了冷害帶來的影響,提高其抗冷性。且黃瓜果實尾部的冷害指數一直低于其他處理組，黃瓜頭部、中部、尾部的抗冷性存在差異,這種差異與POD和CAT的活性以及滲透作用存在密切的聯系。各處理組對黃瓜冷害抑制的程度為熱處理組>對照組，尾部>中部>頭部。