基于多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的食源性病原菌檢測模型的建立與比較

莊蓓蓓，祁釗，周紫卉，黃昊，宋祥軍，邵穎，涂健

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽 合肥，230036)

沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是3種主要的食源性病原菌，近年來關(guān)于3種病原菌引起食物中毒的報道較多[1-3]，大多數(shù)中毒與食用受污染的牛奶、碎牛肉、水和乳制品有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計可知，食源性疾病引起的腹瀉和侵襲性疾病致死多達(dá)23萬人[4]，因此，對食源性病原菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的監(jiān)測是控制和預(yù)防人類食源性病原菌感染的最有效途徑之一。隨著食源性病原菌檢測技術(shù)的快速發(fā)展，檢測技術(shù)從耗時較長的培養(yǎng)基篩選[5]，發(fā)展到特異性較強(qiáng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)[6]和可同時檢測多種病原菌的多重PCR[7]，再延伸到基因探針[8]和生物傳感器[9]等現(xiàn)代常用檢測技術(shù)，這些檢測方法在一定程度上具有快速、有效等優(yōu)點，但是仍存在一些局限性，比如容易出現(xiàn)假陽性、成本高等。因此，迫切需要開發(fā)出一種具有樣品預(yù)處理簡單、成本低、靈敏度高、便于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點的檢測方法。表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman scattering, SERS)利用不同菌種細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成不同，產(chǎn)生獨特的拉曼位移，廣泛應(yīng)用于食品病原菌檢測鑒定[10]。

普通的拉曼信號非常微弱，在強(qiáng)背景熒光中很難被檢測到，為了減少背景熒光的干擾，提高拉曼信號的強(qiáng)度，LAN等[11]采用金納米顆粒基底的拉曼散射，應(yīng)用PCA-HCA分析方法準(zhǔn)確地區(qū)分出鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌之間的差異。為了尋找增強(qiáng)效果更好的拉曼基底，WANG等[12]制備了金包覆磁性納米顆粒，與金黃色葡萄球菌抗體結(jié)合，捕獲細(xì)菌的檢測限低至10 CFU/mL。此外，為了實現(xiàn)SERS技術(shù)在食品安全檢測中的廣泛應(yīng)用，CHO等[13]研究了一種銀增強(qiáng)技術(shù)和膜過濾器輔助的SERS方法用于快速檢測碎牛肉中的大腸桿菌，分別在1和3 h內(nèi)從純培養(yǎng)物和碎牛肉中檢測到極低濃度的大腸桿菌。

隨著納米技術(shù)的進(jìn)步，便攜式拉曼光譜儀已應(yīng)用在食用油、農(nóng)藥和非法添加物等食品檢測中[14-15]，根據(jù)SERS技術(shù)的理論和應(yīng)用實踐，有望建立起快速、特異、靈敏的SERS病原菌檢測。本研究建立的基于多重PCR和SERS技術(shù)的沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌檢測方法，對食源性病原菌快速、精準(zhǔn)的監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

AgNO3、檸檬酸三鈉，西隴化工股份有限公司；DNA marker，生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPCR Master Mix，novoprotein；糞便基因組提取試劑盒，天根生化科技有限公司。

大腸桿菌ATCC 44102、沙門氏菌ATCC 9150、福氏志賀氏菌、巴氏桿菌、變形桿菌、糞腸球菌、蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點實驗室保存；金黃色葡萄球菌ATCC 6538，上海獸醫(yī)研究所饋贈。

1.2 主要儀器設(shè)備

拉曼光譜儀，HORIBA堀場貿(mào)易有限公司；透射電鏡，HT-7700日本日立公司；紫外-可見-近紅外分光光度計，日本島津公司；磁力加熱攪拌器，常州普天儀器制造有限公司；PCR儀、超微量核酸蛋白分析儀，BIO-RAD；核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌基因組DNA提取

采用“水煮法”提取細(xì)菌DNA，取2 mL在LB肉湯中過夜培養(yǎng)的菌液，12 000 r/min離心5 min，生理鹽水洗滌菌體，重懸混勻后置于沸水中煮沸10 min，立即放入-20 ℃冰箱中冰凍30 min，室溫溶解后離心取上清用于PCR擴(kuò)增。

1.4 引物設(shè)計及引物特異性驗證

根據(jù) GenBank 中已發(fā)表的參考序列對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的hilA、uidA和clfA靶基因設(shè)計特異性引物(表1)，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 多重PCR體系建立及條件優(yōu)化

以大腸桿菌ATCC 44102、沙門氏菌ATCC 9150和金黃色葡萄球菌ATCC 6538為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化引物濃度、退火溫度和2×TaqPCR Master Mix用量。多重PCR反應(yīng)體系：mix 12.5 μL，2 μmol/L的上下游引物各1 μL，模板1 μL，超純水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠，電泳后檢測擴(kuò)增片段大小。

表1 PCR引物序列

1.6 多重PCR特異性和靈敏性檢測

分別以標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株和福氏志賀氏菌、巴氏桿菌、變形桿菌、糞腸球菌、蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等陰性對照菌株的DNA為模板，每個樣品加入3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗證多重PCR的特異性。

培養(yǎng)3種陽性菌株混合物至OD600為1.0，涂布平板計數(shù)確定細(xì)菌濃度后倍比稀釋，用于檢測多重PCR菌液靈敏度；提取陽性菌株的DNA，稀釋為不同濃度的DNA模板，檢測多重PCR的DNA敏感性。

1.7 銀溶膠制備

稱取33.72 mg的AgNO3，倒入200 mL滅菌去離子水的錐形瓶中，充分溶解后放置于磁力攪拌器上攪拌加熱15 min直至沸騰，再加入8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉，40 min后停止加熱，待溶液溫度冷卻至室溫后離心濃縮10倍。

1.8 銀納米顆粒的表征

用碳支持膜(銅網(wǎng))蘸取濃縮好的銀納米顆粒以及銀納米顆粒包裹的細(xì)菌樣品，濾紙吸去多余液體，晾干后上樣于透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察銀膠粒徑。

制備的銀溶膠原液稀釋10倍后，取3 mL加入石英比色皿中，使用紫外-可見-近紅外分光光度計對其進(jìn)行光吸收波譜掃描，觀察銀膠粒子的特征吸收峰。

1.9 SERS光譜采集

SERS樣品制備：取1 mL菌液，8 000 r/min離心5 min得菌體沉淀，生理鹽水洗滌2次后加入2 mL銀溶膠，混勻置于石英比色皿,在拉曼儀液體池中進(jìn)行光譜采集。

采用拉曼光譜儀進(jìn)行檢測前使用硅片進(jìn)行校正，以520.7 cm-1峰作為基準(zhǔn)峰，采用785 nm波長的激光器，激光強(qiáng)度設(shè)置為最大強(qiáng)度100 mw，拉曼光譜范圍為400～1 800 cm-1，分辨率為2 cm-1，單次采譜時間為60 s，循環(huán)次數(shù)為1次、狹縫孔徑為200 μm，PCA及光譜數(shù)據(jù)分析使用Origin 2019b軟件。

1.10 表面增強(qiáng)拉曼光譜的靈敏性檢測

菌液制備同1.6多重PCR靈敏度檢測，混合銀溶膠后進(jìn)行SERS采集，用于檢測SERS的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR中驗證引物的特異性

單重PCR驗證引物特異性的加樣內(nèi)容如表2所示，PCR擴(kuò)增電泳圖如圖1-A所示，大腸桿菌uidA擴(kuò)增出536 bp的條帶、沙門氏菌hilA擴(kuò)增出398 bp的條帶，金黃色葡萄球菌clfA擴(kuò)增出246 bp的條帶，引物間無交叉反應(yīng)。

表2 單重PCR驗證引物特異性的加樣內(nèi)容

2.2 多重PCR的特異性檢測

分別以標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株和陰性對照菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1-B所示，陽性菌株均擴(kuò)增出目的條帶，而陰性菌株均未擴(kuò)增出片段，表明多重PCR方法具有較好的特異性。

2.3 多重PCR的敏感性檢測

以稀釋后的陽性菌液為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2-A所示，多重PCR檢測大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最低檢出量為104CFU/mL。

A-單重PCR引物特異性；B-多重PCR特異性檢測;M-DL 600；1～5：dd H2O，混合陽性菌株，ATCC 44102，ATCC 9150，ATCC 6538;6～11:陰性菌株

以不同濃度的陽性菌株DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2-B所示，多重PCR檢測到3種病原菌的最低檢出DNA量為50 pg/μL，具有較高的靈敏度。

A-菌液敏感性;B-DNA敏感性;M-DL 600;A-1～8：dd H2O，混合陽性菌株，109，108，107，106，105，104 CFU/mL；B-1～12：dd H2O，混合陽性菌株，200 ng，100 ng，50 ng，10 ng，2 ng，1 ng，200 pg，100 pg，50 pg，10 pg

2.4 銀納米顆粒的表征

紫外可見光譜法和透射電鏡觀察是用于AgNPs結(jié)構(gòu)表征的最廣泛使用的技術(shù)，透射電鏡觀察到銀納米顆粒呈球狀，大小均勻，粒徑約40 nm(圖3-A)。紫外可見光譜法檢測到銀膠的吸收峰在410 nm左右(圖3-B)。

A-銀納米顆粒的TEM圖;B-銀溶膠的紫外吸收峰

2.5 銀納米顆粒包裹細(xì)菌的TEM表征

為研究銀納米顆粒是如何增強(qiáng)拉曼信號的，TEM觀察菌體與銀溶膠混合樣品，結(jié)果如圖4所示，銀納米顆粒均勻包裹在菌體表面，用以增強(qiáng)拉曼信號。

圖4 銀納米顆粒包裹細(xì)菌的TEM圖

2.6 三種菌株SERS譜峰的比較

在400～1 800 cm-1范圍內(nèi)采集拉曼信號，SERS掃描結(jié)果如圖5所示，比較3種細(xì)菌的SERS譜峰，可觀察到730和1 330 cm-1左右處的2個強(qiáng)峰為腺嘌呤的典型拉曼特征，此外，大腸桿菌的主要特征峰在626、652、728、956，1 128、1 336、1 461、1 639、1 709 cm-1，沙門氏菌在454、524、643、729、1 009、1 118、1 329、1 395、1 458、1 643 cm-1有明顯的拉曼振動譜峰，而金黃色葡萄球菌的拉曼振動譜峰主要在634、732、1 207、1 276、1 340、1 379、1 460、1 547、1 636 cm-1。3者的譜峰特征有很大差異，可以作為區(qū)分3種細(xì)菌的依據(jù)。

圖5 大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌SERS譜峰

2.7 PCA模型的建立

3種標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCA結(jié)果如圖6所示，前2個主成分的累積貢獻(xiàn)率是93.8%，第一、第二主成分包含了大部分光譜數(shù)據(jù)所具有的信息，PCA圖中可以看出大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌各自聚集在一起，因此，認(rèn)為3種菌株的譜峰顯著不同，可以明顯地區(qū)分開。

2.8 SERS的靈敏度檢測

如圖7所示，SERS檢測大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低檢出量為104CFU/mL，沙門氏菌最低檢出量為103CFU/mL。

圖6 大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌3種標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCA分析

圖7 SERS的靈敏度檢測

3 結(jié)論與討論

本研究為了同時檢測出3種食源性病原菌，建立了基于大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌uidA、hilA和clfA基因的三重PCR檢測方法，結(jié)果表明，3對引物擴(kuò)增出的目的片段僅存在于陽性菌株，具有良好的特異性。GONG等[16]檢測到金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的檢測限為100 pg/μL，而本研究的最低檢出DNA量為50 pg/μL，說明了本研究的檢測效率更高；此外，WEI等[17]在大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌培養(yǎng)液中檢出限為103CFU/mL，在模型食品體系中檢出限為104CFU/mL。本研究建立的多重 PCR 體系檢測3種細(xì)菌最低檢出量為104CFU/mL，敏感性的差異可能與細(xì)菌混合培養(yǎng)的組成或反應(yīng)體系有關(guān)。在實際樣品檢測中，只有一種細(xì)菌存在的情況很少，復(fù)雜的檢測環(huán)境對檢測結(jié)果有很大的影響，為了進(jìn)一步接近樣品實際檢測效果，增加檢測的時效性，本研究檢測多重PCR敏感性的樣品是3個目標(biāo)細(xì)菌混合共培后的菌液。

本研究對銀納米顆粒的表征可知粒徑約為40 nm，這與MARWA等[18]的研究結(jié)果一致。與以往的研究相比[19]，SERS譜峰的分布基本相同，只是在波數(shù)上存在一些時相。PCA的前2個主成分的累積貢獻(xiàn)率為93.8%，研究認(rèn)為3種細(xì)菌有顯著差異。相比SUNDARAM等[20]鑒別食源性病原菌PCA分析的96%，主要區(qū)別于在制備銀納米顆粒時未使用聚乙烯醇，而聚乙烯醇主要作用是防止銀溶膠發(fā)生團(tuán)聚。楊丹婷[21]以Ag NPs為基底最低檢測到105CFU/mL的大腸桿菌，WANG等[22]檢測沙門氏菌的檢測限為104CFU/mL，本研究檢測大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低檢出量為104CFU/mL，沙門氏菌為103CFU/mL，而在CHONGWEN等[23]的研究中，使用萬古霉素修飾的Ag包覆磁性納米顆粒，檢出限低至5×102CFU/mL，由此可見，特異性基底的制備可以加強(qiáng)SERS檢測的靈敏性。

SERS與多重PCR檢測相比較，后者需要經(jīng)過提取模板、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠驗證等過程，而SERS只需要進(jìn)行拉曼掃描和結(jié)果比對，檢測時間相對節(jié)約了3 h。相對于多重PCR而言，SERS方法提高了沙門氏菌的檢測限，而且最近開發(fā)的各種標(biāo)簽修飾技術(shù)，比如特異性抗體修飾[24]、適配體修飾[25]的SERS技術(shù)以及萬古霉素和適配體的雙重識別[26]使得SERS技術(shù)檢測食源性致病菌的特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。隨著便攜式拉曼光譜儀在食品檢測的應(yīng)用，SERS的現(xiàn)場快速檢測成為可能，對食品安全的監(jiān)測具有重要意義。