基于近紅外免疫層析技術快速檢測食源性甲型肝炎病毒

萬曉楠,暢曉暉,齊瑋,高欣,喬彬,楊向瑩,李小林,張惠媛,石嵩,張捷*,周熙成

1(北京海關 技術中心，北京，100026)2(皇崗海關 機關服務分中心，廣東 深圳，518000)

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)是人類病毒性疾病的重要病原體，它是一種無包膜的核糖核酸(RNA)，屬于小核糖核酸病毒科，通過人與人之間的接觸或攝入受污染的水或食物感染健康人群。它廣泛存在于自然界中，感染甲肝病毒的潛伏期可持續15～50 d[1]。據統計全世界約有130萬人死于病毒性肝炎，其中甲型肝炎病毒急性感染約11 000例死亡、戊型肝炎病毒約44 000例死亡，兩者均會引起肝炎和肝功能衰竭[2]。最常見的食物包括雙殼軟體動物貝類、各種鱗莖類蔬菜等易感染此類病毒而引發疾病，該病毒在冷藏食品也較常見[3]。

傳統的甲型肝炎病毒檢測方法耗時費力，無法快速有效地檢測甲型肝炎病毒。比如細胞培養法，甲型肝炎病毒難以適應細胞，培養周期太長，因此無法進行檢測。目前甲型肝炎病毒的檢測方法主要包括分子生物學、DNA微陣列和電化學免疫傳感器等。實驗人員采用普通PCR法對甲肝病毒的目標基因進行特異性擴增，但對于給定的樣品PCR無法定量負荷病毒，靈敏度不高，所以該法在檢測中受限；熒光RT-PCR法，耗時較短價格相對便宜，在實驗室中較為推廣，但精細操作對實驗人員技術要求較高，同時缺乏對甲肝病毒感染性的指征。近年來DNA微陣列可以替代PCR法,鑒定樣品序列的單核苷酸多態性，但其價格昂貴，不適用于實驗室常規檢測[4-6]。電化學免疫傳感器可以同時檢測到不同的甲肝病毒抗原，靈敏度較高，但同樣價格昂貴，需要大量的納米金顆粒和蛋白A，步驟復雜從而增加檢測成本[7]。因此為了進一步提高口岸檢出進出境食品中甲型肝炎病毒的效率，本研究針對甲型肝炎病毒，采用近紅外dylight 800熒光染料制備近紅外免疫層析試紙條進行快速檢測，可用于貝類等食品中甲肝病毒的高效檢測，為進出口食品安全監管提供可靠的技術支持。

1 實驗材料

1.1 病毒

甲肝病毒，由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供。

1.2 主要儀器與試劑

高速低溫離心機，德國Sigma公司；超純水儀，美國賽默飛公司；高壓滅菌設備，江蘇萬創滅菌設備科技有限公司；近紅外點熒光掃描儀，北京博潤福得科技發展有限公司。

熒光染料dylight 800，美國賽默飛世爾公司；鼠抗甲肝病毒單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)、羊抗雞免疫球蛋白，上海慧耘生物科技公司、羊抗甲肝病毒衣殼蛋白多克隆抗體，艾博抗Abcam公司；TaqDNA聚合酶、試劑盒，生物工程有限公司。

2 實驗方法

2.1 近紅外熒光染料標記甲肝病毒單克隆抗體

標記抗體的制備方法如下：

參照文獻[22]所述方法，首先取100 μL磷酸鹽緩沖液稀釋好的鼠抗甲肝病毒單抗(質量濃度為1 mg/mL)，然后加入dylight 800熒光染料渦旋混勻后于室溫避光。1 h后加入100 μL磷酸鹽緩沖液混勻，終質量濃度為0.5 mg/mL。

劃膜抗體的制備方法如下：

參照文獻[22]所述方法,用劃膜液稀釋羊抗甲肝病毒多抗1.5 mg/mL，最后將標記抗體放入磷酸鹽緩沖液中，4 ℃透析過夜，回收抗體作為最終標記抗體。

2.2 甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條的制備

將樣品墊、結合墊、抗體承載膜、吸水墊及反應支持基質按圖1所示依次搭接，切割機將其切成試紙條。采用劃線機，將劃膜抗體(羊抗甲肝病毒多抗1.5 mg/mL)和羊抗雞IgY多抗劃在抗體承載膜上，分別作為檢測線(T)和質控線(C)，檢測線、質控線間距0.5 cm，室溫風干。

1-樣品墊；2-結合墊(含有近紅外熒光染料標記抗體的玻璃纖維素膜)；3-硝酸纖維素膜(抗體承載膜)；4-檢測線；5-質控線；6-吸水墊；7-反應支持基質

2.3 定性檢測

實驗人員使用配制好的層析緩沖液分別稀釋標記抗體(鼠抗甲肝病毒單抗)和羊抗雞免疫球蛋白IgY(稀釋比為1∶50、1∶2 000)(質量濃度0.5 mg/mL)，鼠抗甲肝病毒單抗稀釋液與羊抗雞免疫球蛋白IgY 按1∶1比例渦旋混勻。隨后在上述溶液中，滴加甲肝病毒稀釋液(100 μL病毒稀釋液+4 μL混合液)渦旋混勻，滴加至制備好的近紅外免疫層析試紙條樣品墊上，充分反應15 min后，采用便攜式近紅外熒光掃描儀檢測。

2.4 定量檢測

標準曲線繪制：用PBS稀釋液(含5%BSA、0.1%Tween 20)將1 mg/mL的HAV抗原(HAV 抗原為猴腎細胞培養后的滅活全病毒)進行倍數系列稀釋，分別按照表1，制成不同濃度的稀釋樣品；根據數學統計原理，繪制成標準工作曲線。每個稀釋度樣本平行測量2次，取平均值作為測量值，以該值對應的樣品濃度作標準工作曲線。

表1 甲肝病毒實時熒光PCR反應體系

2.5 特異性實驗

在無菌條件下，將5種食源性病毒包括腺病毒、諾如病毒、輪狀病毒Wa、輪狀病毒SALL和腸道病毒71型(EV71)原液稀釋，稀釋液按3∶7體積比與4 μL制備好的層析混合液渦旋混合，隨后滴加到樣品墊上，室溫放置15 min后，近紅外熒光掃描儀檢測近紅外免疫層析試紙條。

3 評價方法

3.1 RT-PCR檢測方法

貝類、海螺絲、蟶子等15份樣品，均來自北京海關技術中心食品實驗室。

貝類、海螺絲等前處理方法均按照國家標準[8]進行檢測。

3.2 甲肝病毒實時熒光RT-PCR

引物序列如下所示：

正向引物5’-TTTCCGGAGCCCCTCTTG-3’，

反向引物5’-AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC-3’

探針序列5’-FAM-ACTTGATACCTCACCGCCG TTTGCCT-TAMRA-3’

采用甲肝病毒試劑盒試劑盒：sureFast Norovirus/Hepatitis A 3plex。

3.3 染毒實驗組貝類樣品的處理

用鑷子等工具分別稱取貝類、海螺絲、蟶子等樣品(未檢出甲肝病毒)各消化腺1g，用7 mL甘氨酸緩沖液(pH 9.6)用超聲波方法對消化腺進行粉碎，并將上清液加入，進行樣品濃縮。

3.4 用實際樣品進行符合性評價

按照所建立的甲肝病毒近紅外免疫層析法，對15份實際樣品(北京海關技術中心食品實驗室)進行檢測，并將近紅外檢測結果與熒光RT-PCR法進行比較。

3.4.1 貝類樣品甲肝病毒的富集

按照3.3建立的方法，15份貝類樣品進行前處理后充分研磨。采用離心分離過濾膜過濾的方式形成待測物。

3.4.2 檢測

來自實驗室的15份貝類樣品分別按照3∶7比例再加4 μL混合液滴加到近紅外免疫試劑條樣品墊上，分別做兩個平行實驗，室溫反應15 min后用近紅外熒光掃描儀檢測。

4 結果分析

4.1 定性檢測

根據2.3定性檢測方法，發現若貝類、蟶子等食品樣品中含有甲型肝炎病毒(目標病毒)，目標病毒將與結合墊中的熒光標記單抗形成甲肝病毒抗原-抗體復合物。然后抗原抗體復合物通過毛細管作用移動至檢測線，發生抗原抗體免疫反應，被它們各自的特異性多抗捕獲。結果表明，若甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條質控線(T)區域不存在(未出現熒光發射峰)，則認為該測試無效。若T線區域、C線區域同時出現熒光發射峰，則認為檢測結果為陽性；若僅T線區域測試出現熒光發射峰則為陰性結果。

圖2 甲肝病毒低噪聲激發式熒光檢測圖

4.2 定量檢測

按照2.4定量檢測方法進行試驗，用移液器加50 μL已知濃度的甲肝病毒至樣品墊，待樣品吸收后再滴加50 μL配制好的層析液,室溫靜置10 min。低噪聲激發式熒光掃描儀檢測甲肝病毒標準品，樣品中的目標檢測物甲肝病毒采用近紅外光標記，甲肝病毒濃度通過反射光強度表征。掃描獲得檢測線(T)和質控線(C)的熒光峰值，若兩者同時出現發射峰，則為陽性樣品。將樣品測試2次后取平均值，檢測結果見表2。

表2 不同質量濃度甲肝病毒標準品對應檢測結果

以檢測峰值對相應的樣品質量濃度制作標準工作曲線，如圖3所示得出計算公式Y=0.018 8x+0.232 5，R2=0.958 8。結果顯示，甲肝病毒質量濃度在1～100 μg/mL時，熒光比值與質量濃度線性關系良好，即線性范圍1～100 μg/mL。檢測限為1 μg/mL。

圖3 甲肝病毒近紅外免疫層析標準曲線

4.3 特異性實驗

按照2.5實驗方法將5種病毒包括諾如病毒、輪狀病毒Wa病毒株(rotavrius strain Wa)、腸道病毒71型(EV71)等原液稀釋后，分別滴加入甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條進行檢測。僅甲肝病毒檢測線區域和質控線區域出現熒光峰值，其余5種病毒均未出現檢測線發射峰。由此可見本團隊研制的甲肝病毒免疫層析試紙條與腺病毒、腸道病毒EV71、輪狀病毒、諾如病毒等均無交叉反應。

4.4 近紅外免疫層析法、熒光RT-PCR法比較

按照3.4實驗方法對北京海關技術中心實驗室15份貝類樣品進行檢測。檢測結果發現15份貝類、蟶子等樣品的近紅外免疫層析法和熒光RT-PCR檢測結果一致，結果均為陰性(如表3所示)。甲肝病毒近紅外熒光法與熒光RT-PCR法的符合率達到100%。

表3 本方法與熒光RT-PCR法比較

5 討論

甲型肝炎病毒是一種正鏈RNA病毒，非細菌性肝炎的重要病原體[2]，易被其感染的食物類別多為海鮮，包括貝類、蟶子、生的肉類等缺少熱處理的食品[9-11]。研究發現，甲型肝炎病毒(HAV)感染通常是自限型的并且誘導永久的主動免疫。目前RT-PCR是最為通用、常見的檢測法，但其檢測特異性和靈敏性不是很高[12]。近年來，澳大利亞、美國、日本等檢測食源性甲肝病毒，通常采用RT-PCR檢測目標基因，可達到10～40 copy的病毒核酸。但由于食品種類繁多，成分較為復雜，大多會富含RT-PCR的抑制劑，靈敏度會很大程度地減低，因此該法存在一些局限性。20世紀90年代初期，研究人員采用斑點金免疫結合法進行甲肝病毒抗體的檢測[13]。其優點是操作簡單快捷，膠體金試劑保存時間長，但實驗人員易將弱陽性標本誤讀，性價比和準確度不高。基因芯片檢測法具有信息量大、高度平行化和集成化等特點，適用于各種病原體的篩查和診斷。目前基因芯片法需建立穩定的標準程序才能在病毒篩查和傳染病的預防中廣泛應用[14]。2014年喬煜婷等[15]將制備的特異性甲肝病毒免疫磁珠與SYBR-GREEN熒光定量技術聯合使用成功檢測了水體中的甲型肝炎病毒，該法主要適用于環境中甲肝病毒污染狀況的評價。

近年來，近紅外熒光免疫層析技術在醫學診斷、環境微生物、生物物理學等各領域受到廣泛關注[16-18]。近紅外免疫層析技術是將近紅外熒光與免疫層析技術相結合的一種新型側向流技術，具有背景熒光低、檢測信噪比高，檢測靈敏度高的特點。2017年JIHANE等[19]通過將甲肝病毒HAV固定在碳納米粉末糊狀電極的表面上，開發了用于甲型肝炎病毒抗原(HAV)檢測的間接競爭性電化學免疫傳感器，具有良好的穩定性和高生物選擇性，也成功應用于水樣中HAV的測定，但檢測成本昂貴，操作步驟繁瑣，難以在實驗室推廣。本研究利用近紅外染料標記抗體，依據雙抗體夾心免疫層析原理制備甲肝病毒免疫層析試紙條，選用熒光探針Dyligh 800信噪比較高，靈敏度較高，生物基體極少在該區域自發熒光，使得背景熒光干擾較少。基于750 nm波長的熒光免疫層析試紙條對甲肝病毒的最低檢測限為1 μg/mL。

2015年開始本團隊采用近紅外熒光染料dyllight 800作為標記，研制出一系列近紅外熒光免疫層析試紙條檢測食源性致病微生物, 檢測對象包括沙門氏菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、諾如病毒等[20-23]。本研究將近紅外熒光探針與免疫層析技術結合制備了甲肝病毒近紅外免疫層析試紙條，該試紙條能夠應用于進出口食品類樣品中的甲肝病毒實時檢測，具有結果準確、高效的特點，同時便于攜帶，能夠為食品安全的監管、現場查驗提供強有力的技術支撐。

致謝感謝中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所張曉光老師研究團隊和中國科學研究院理論物理所舒咬根研究團隊對本研究的大力支持和幫助。