草莓4種主要病毒檢測及SVBV貴州分離物基因組測定及分析

王 廿，賈蒙驁，黃 剛，卯婷婷，趙玳琳，陶 剛*

(1. 貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550003；2. 貴州省煙草科學院，貴州 貴陽 550005；3. 黔東南州民族職業技術學院，貴州 凱里 556000)

【研究意義】草莓(Fragaria×ananassa)為薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)宿根性多年生草本植物，花白色，屬于漿果類水果；主要分布于亞洲、南美洲、歐洲等地[1-2]。近年來隨著設施農業的發展，草莓的栽培面積和產量在世界漿果類水果中躍居第2位，僅次于葡萄，貴州草莓的栽培面積也在逐漸擴大[3-4]?！厩叭搜芯窟M展】生產上栽種農戶購買的草莓種苗后多自行繁殖2～3代，由于草莓種苗通過匍匐莖營養繁殖而來，一旦母株帶毒，繁殖的后代均帶毒。單一病毒對草莓生長和產量無明顯影響，2種以上病毒復合侵染常導致草莓產量逐年遞減，成為草莓生產的巨大隱患[5]。在我國露地常規繁殖的草莓種苗，其病毒感染率為每年20 %～30 %，導致產量降低20 %～50 %[6]。植物病毒病害一旦發生難以控制，造成植株的長勢減弱，從而增加了其他病害的侵染幾率，若從根本上解決病毒病的危害，需將病毒的檢測和預防提前到草莓組培苗和種苗圃草莓病毒病的檢測與及時清除，從而可保證在生產田使用無毒種苗栽培。我國草莓種植中有4種常見的病毒病害，分別是草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus，SVBV)、草莓斑駁病毒(Strawberrymottleirus，SMoV)、草毒皺縮病毒(Strawberrycrinklevirus，SCV)和草莓輕型黃邊病毒(Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV)[5-6]。目前頒發的中華人民共和國農業行業標準NY/T303《草莓脫毒種苗生產技術規程》將脫毒種苗分為脫毒原原種苗、脫毒原種苗和脫毒種苗三級，規范中明確種苗病毒的檢測方法為RT-PCR，包括SVBV、SMoV和SMYEV等3種病毒的檢測，均為陰性才為合格的種苗。草莓病毒最早的檢測依賴于比較復雜的電鏡技術和接種指示植物方法，這些方法特異性周期長，不易掌握[6-7]。隨著分子生物技術的發展，草莓病毒的檢測也從單個病毒的檢測，逐漸發展為多重RT-PCR方法[8]和實時熒光定量PCR的方法[9]，提高了檢測效率和檢測靈敏度和重復性。利用Illumina測序技術能同時發現多種病毒，如李偉佳等[10]進行轉錄組測序在疑似病毒癥狀的草莓葉片分析發現，草莓壞死休克病(Strawberrynecroticshockvirus，SNSV)、SVBV、SCV和SMYEV等4種草莓病毒，用RT-PCR技術對轉錄組測序結果進行了驗證。Akhter等[11]研究分析侵染草莓的病毒與侵染黃瓜株系的差異，Bhagwat等[12]研究發現加拿大東部SMYEV分離物的特異性，說明一些新病毒或是草莓病毒種間變異在田間的廣泛發生。為了對草莓病毒病發生的危害草莓生產，持續的監測和明確不同區域的病害發生的差異，是進行針對性防控的基礎[10-12]。【本研究切入點】鐘霈霖等[13]通過雜交選育出適宜在貴州地區栽培具有早熟、高產、抗病和抗逆等特點的新品種：黔莓1號、黔莓2號和黔莓3號；同時，研究人員在貴州地區也開展了莖尖組培草莓種苗的研究[14]。但貴地區的草莓病毒發生情況以及病毒的遺傳關系尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】因此，對貴州地區草莓病毒病害的發生情況進行調查，對生產田草莓植株和組培植株進行常見4種病毒的檢測，擴增SVBV基因組全長并分別根據SVBV全基因組序列和完整CP基因序列進行系統發育分析、病毒的遺傳變異分析，為無毒種苗的安全生產和田間防控提供理論基礎和指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 于2017年分別采集貴州省貴陽市園藝所溫室大棚、黔東南州凱里市下司鎮溫室大棚和黔東南州民族職院組培中心的草莓植株22、23和32份，品種分別為黔莓1號、紅顏和章姬。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株和克隆載體pMD-19T等購自天根生化科技(北京)有限公司，內標基因、SVBV、SCV、SMoV和SMYEV等片段構建的基因陽性質粒由北京市植物保護站席昕助理研究員提供。

1.1.3 分子生物學常用酶及試劑盒 EASY spin植物RNA快速提取試劑盒和植物基因組DNA快速提取試劑盒等購自北京艾德萊生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒和PCR Master mix購自天根生化科技(北京)有限公司，RNA Inhibitor和LATaqDNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司，M-MLV Reverse Transcriptase購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，dNTP和引物合成購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參考文獻[15-16]研究草莓病毒檢測的引物進行PCR擴增；已檢測到SVBVCP基因片段的樣品cDNA為模板，進行SVBV全長序列的擴增和SVBVCP基因的擴增引物參考引物見表1[16-17]，其中部分引物根據NCBI上登錄的SVBV-SY(GenBank登錄號：KP311681)、SVBV-BJ(GenBank登錄號：KR080547)和SVBV-AH(GenBank登錄號：KX787430)等分離物序列比對后，根據保守的核苷酸序列重新設計。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR擴增 采用試劑盒提取草莓葉片總RNA，反轉錄反應體系為25 μl：在1.5 mL管中加入2 μl總RNA(約1 μg)、隨機引物N(6)和Oligo d(T)18引物各0.5 μl、0.5 μl RNase Inhibitor和15 μl去RNA酶ddH2O，70 ℃加熱5 min，立即至于冰上，3 min后加入5 μl 10×M-MLV buffer和1 μl M-MLV反轉錄酶，42 ℃反應60 min；72 ℃反應10 min。RT-PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s或3 min(擴增SVBV全長)，循環30次；72 ℃延伸5 min，20 ℃保存5 min。反應結束后取3 μl PCR產物用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性產物送至上海生工測序。

表1 草莓SVBV CP基因及全長基因組擴增的引物Table 1 Primers for amplication of CP and genomic sequence of SVBV

注：*為參考序列：SVBV-BJ，GenBank: KR080547.1。#為新設計的引物。

Note: * Reference sequence: SVBV-BJ, GenBank: KR080547.1. # newly designed primers.

1.2.3 SVBV 3個片段PCR擴增及克隆 采用試劑盒提取草莓葉片DNA，將SVBV全長分為3個片段擴增，其中1對引物參考FENG等[17]研究，根據全基因組比對后進行設計另外2對引物(表1)。PCR產物電泳后切出單一目標條帶，用凝膠回收試劑盒進行回收，具體方法參照試劑盒說明書。回收后連接到pMD-19T vector，連接產物轉到DH5α感受態細胞中，涂布于含氨芐(50 mg/L)的固體LB培養基上，經過37 ℃培養16 h。挑取單菌落至于含氨芐(50 mg/L)的液體LB培養基于轉速為180 r/min振蕩培養箱中過夜。取1 μl菌液通過PCR鑒定，挑選出陽性克隆，送至上海生工進行測序。

1.2.4 SVBV CP基因的擴增及克隆 采用試劑盒提取草莓葉片DNA，通過引物SVBV CP F和SVBV CP R引物對擴增SVBV的CP基因全長，將獲得的PCR產物參考1.2.3的方法構建到載體上，送陽性克隆到上海生工進行測序。

1.2.5 擴增序列分析 擴增的SVBV3個片段陽性克隆測序結果，經DNAman軟件進行拼接；GenBank中下載已經可獲得的5條SVBV基因組序列和試驗獲得的貴州分離物全長，采用軟件Clustalx進行序列比對，在GenBank下載22條SVBV CP核苷酸序列和測序獲得的CP核苷酸序列采用軟件Clustalx進行比對；將比對文件導入MEGA7.0采用鄰接法進行1000次bootstrap重復計算遺傳距離[18]。

2 結果與分析

2.1 常見4種草莓病毒的RT-PCR檢測

經檢測，77份樣品均可擴增獲得內標基因的片段，說明檢測樣品的RNA提取、cDNA合成均良好。以cDNA為模板以SVBV引物對進行RT-PCR，在7株樣品中擴增到約270 bp的片段，經測序及BLAST分析發現該片段與SVBV-BJ(GenBank登錄號：KR080547)同源性最高；以SMYEV引物對進行RT-PCR，在2株樣品中擴增到約850 bp的片段，經測序及BLAST分析發現該片段與SMYEV(GenBank登錄號：NC003794 )同源性最高。未在任何樣品中擴增到SMoV和SCV的預期大小片段，其中所有檢測的陽性對照和陰性對照均與預期相符。通過RT-PCR檢測到SVBV和SMYEV病毒，未檢測到SMoV和SCV病毒；其中SVBV檢出率為19.5 %，SMYEV檢出率為2.6 %(表2)。

表2 檢測樣品4種草莓病毒病的帶毒率Table 2 The incidence of four strawberry viruses in samples

2.2 SVBV貴州分離物基因組測序及一致性

對SVBV進行PCR擴增獲得與引物設計預期大小相符的條帶，分別為2.8、2.9和3.3 kb(圖1)。通過序列拼接后獲得SVBV-GZ(GenBank登錄號：MH894295)貴州分離物基因組序列，全長7859 bp。將SVBV-GZ各編碼蛋白序列和核苷酸序列分別于報道的其他6個SVBV分離物進行比對(表2)?；蚪M核苷酸相似性在84.57 %～98.59 %，與SVBV-BJ分離物(GenBank登錄號：KR080547)相似性較高，達98.78 %，與pSVBV-E3分離物(GenBank登錄號：X97304)差異最大，僅84.57 %。其中SVBV-GZ的移動蛋白和病毒粒子相關蛋白的氨基酸序列與SVBV-BJ的和SVBV-AH的氨基酸相似性最高為100 %，與美國分離物蚜蟲相關蛋白氨基酸序列最低，為70.19 %。目前，已獲得SVBV7個分離物的全基因組序列：SVBV-GZ、SVBV-China(GenBank登錄號：KR080547)、SVBV-SY、SVBV-BJ、SVBV-AH、SVBV-NS(GenBank登錄號：KX950836)和pSVBV-E3等，在預測編碼的6個開發讀框中，蚜蟲相關蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列變化較大，分別為75.51 %～99.59 %和70.19 %～99.38 %；反轉錄酶的核酸序列和氨基酸相似性最高，分別為89.13 %～98.21 %和93.75 %～99.29 %。

分析SVBV-GZ序列，推測其編碼7個開放閱讀框(Open reading frames, ORFs)，與之前報道的SVBV分離物相似，同屬于花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)花椰菜花葉病毒屬(Caulimovirus)。開放閱讀框Ⅰ(核苷酸 70～1059)推測編碼移動蛋白(329 個氨基酸)，開放閱讀框Ⅱ(核苷酸1062～1550)推測編碼蚜蟲傳相關蛋白(162氨基酸)，開放閱讀框Ⅲ(核苷酸1551～1901)推測編碼病毒粒子相關蛋白(116氨基酸)；開放閱讀框Ⅳ(核苷酸1904～3319)推測編碼外殼蛋白(471氨基酸)；開放閱讀框Ⅴ(核苷酸3411～5525)推測編碼一個反轉錄酶(704氨基酸)；開放閱讀框Ⅵ(核苷酸5537～7099)推測編碼內含體基質蛋白(520氨基酸)；開放閱讀框Ⅶ編碼的蛋白為107氨基酸。非編碼區有513 bp(核苷酸7100～7612)在開放閱讀框Ⅵ和開放閱讀框Ⅶ之間，該區段核苷酸序列與報道的加拿大分離物NS8的相似性達98.45 %，在這段區域中有真核生物啟動子TATA框(核苷酸7217～7223)和類CAT元件(核苷酸7208～7212)，轉錄ploy(A)信號(核苷酸7322～7328)。

M, DL5000 DNA Marker; 1, SVBV1 F/SVBV1R; 2, SVBV2 F/SVBV2new R; 3, SVBV3new F/SVBV3new R圖1 SVBV-GZ全基因組序列3個片段的擴增Fig.1 Amplification of three fragments of SVBV-GZ genomic sequence

2.3 SVBV-GZ與其他分離物系統進化關系

基于SVBV基因組核酸序列構建系統發育樹表明，7個分離物可分為2個亞組，pSVBV-E3分離物為其中一個亞組，其他6個分離物在另一亞組。SVBV-AH和SVBV-SY在同一分支上，SVBV-BJ和SVBV-GZ在另一分支上(圖2)。對8條加拿大、8條中國和1條埃及等17條SVBV分離物CP氨基酸序列構建系統發育樹(圖3)表明，來自不同地區的SVBV分離物主要歸為3個大類(圖2)，一組(Group Ⅰ)包括了來自加拿大的所有分離物，另一組(Group Ⅱ)包括了中國的所有分離物，還有一組只包括來自埃及(Group Ⅲ)的分離物。由圖3表明，SVBV分離物與來自加拿大和埃及的分離物處于不同類群，結果與全長基因組序列構建的系統發育樹符合；SVBV-GZZJ和SVBV-GZFLD與來自北京、安徽和沈陽的SVBV分離物較近的親緣關系，SVBV-GZHY和SVBV-GZQ3與上分支親緣關系相對較遠。

3 討 論

早在1995年，我國病毒學家依靠血清學反應，明確了國內草莓種苗和田間植株中帶毒率較高的4種病毒。由于SVBV是DNA病毒可直接通過PCR進行檢測[19]，檢測結果與RT-PCR檢測結果無差別，為方便試驗操作全部用cDNA為模板進行檢測。采集時檢測的樣品未呈現的葉片褪綠、皺縮或植株矮小等癥狀，對這些植株進行草莓常見4種病毒的檢測結果顯示沒有符合侵染的植株，與之前報道草莓病毒單獨侵染不會造成明顯的癥狀較相符[20]。草莓大棚種植一般采用上一年的匍匐莖上萌發的新苗為種苗，如果母株帶毒則子代將全部為帶毒苗，建議在草莓苗圃和組培苗繁殖過程加強病毒的檢測[21-22]。由于SVBV和SMYEV的田間傳播介體主要為蚜蟲[21]，因此在草莓苗圃應加強蚜蟲的防控。

試驗研究首次克隆了SVBV貴州分離物全基因組序列，分析其基因組結構特征。目前在NCBI的數據庫中已有我國SVBV的中國分離物、北京分離物、沈陽分離物和安徽分離物的全基因組序列，將獲得的貴州分離物SVBV-GZ全基因組序列、其他中國地區分離物、加拿大分離物和美國分離物進行系統發育分析。中國地區分離物與加拿大分離物聚在同一組。進一步分析基于SVBV CP氨基酸序列構建的系統進化樹分析發現，SVBV-GZZJ(樣品品種為章姬)和SVBV-GZFLD(樣品品種為法蘭蒂)與北京、安徽和沈陽的SVBV分離物親緣關系較近，其樣品采集地在凱里市下司鎮大棚，主要從外省購買種苗種植；SVBV-GZHY(樣品品種為紅顏)和SVBV-GZQ3(樣品品種為黔莓3號)與安徽和沈陽的SVBV分離物親緣關系相對較遠且為另一個分支，北京SVBV分離物較近，其樣品采集地為貴陽市郊區，種苗來自貴州省園藝所，可能由于該所地理上隔離栽培、選育和繁殖草莓超過10年，SVBV經過進化與其他分離物出現更多差異。

圖2 基于SVBV-GZ全長基因組序列的SVBV分離物系統進化關系Fig.2 Phylogenetic relationships of SVBV-GZ with other reported isolates based on genomic

圖3 基于SVBV外殼蛋白氨基酸序列的SVBV分離物之間的系統進化關系Fig.3 Phylogenetic relationships of SVBV isolates based on its coat protein amino acid sequences

4 結 論

試驗通過RT-PCR檢測發現貴州省草莓植株有SVBV和SMYEV 2種病毒，未發現SMoV和SCV，測定的SVBV-GZ全基因組序列與已報道的SVBV-BJ分離物的序列相似性最高。