煙草秸稈中產纖維素酶細菌篩選、鑒定及酶活測定

李正風，朱 杰，唐 麗，董高峰，吳 濤，廖頭根，張 偉，夏玉珍，王奕權，李 巖

(1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231；2.紅塔煙草(集團)有限責任公司，云南 玉溪 653100；3.北京微普聯合生物科技有限公司，北京 102200)

【研究意義】纖維素是地球上儲量最豐富的可再生性能源物質，全球植物每年新和成纖維素產物達29億t左右[1]，中國每年秸稈類纖維素產量達7億t[2]。大量的秸稈被焚燒或丟棄造成資源浪費[3]，秸稈類物質是生態有機質資源，腐熟還田能增加土壤有機質含量、改善土壤質量、減輕長期施加化肥對土壤的影響、提高農作物產量和品質[4]。云南是中國煙草的主產區，每年煙葉收獲后產生大量的廢棄秸稈，這些秸稈的隨意堆放及丟棄不僅會影響環境而且容易引發火災。【前人研究進展】研究顯示，不同作物的秸稈還田能提高土壤團聚體穩定性[5]，改良植煙土壤且利于提高煙草品質。產纖維素酶菌株的應用能提高秸稈類物質的腐熟效率[6]，縮短發酵周期，加快秸稈還田效率。【本研究的切入點】從云南煙草秸稈自然腐熟物中選擇性分離產纖維素酶菌株，對菌株進行初篩選定部分酶活較高的菌株進行分子生物學鑒定，通過復篩確定高效菌株，并對產纖維素酶條件進行優化。【擬解決的關鍵問題】為促進煙草秸稈堆肥還田提供了優良種質資源，所篩選的高效菌株和優化的產酶條件將利于纖維素酶的純酶產品開發。

1 材料與方法

1.1 材料采集

樣品取自云南曲靖、彌勒煙草秸稈自然堆肥樣品。

1.2 產纖維素酶菌株分離

稱取堆肥樣品1 g于10 mL滅菌生理鹽水(0.85 %)中，28 ℃搖床，200 r/min震蕩10 min，分別梯度稀釋10-1～10-8，并分別取100 μl涂布于分離培養基(羧甲基纖維素鈉培養基：羧甲基纖維素鈉5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂15 g、蒸餾水 1000 mL)上。28℃倒置培養5～7 d。分別挑取單菌落至羧甲基纖維素鈉培養基反復劃線純化，直至純化。并分別保藏至20 %甘油中，-80 ℃冷凍保藏。

1.3 產纖維素酶菌的初篩

將純化后的菌株點接在羧甲基纖維素鈉平板上，28 ℃倒置培養5 d，測定菌落直徑(D)，在平板上加入剛果紅染液(1 g/L)沒過菌落，常溫1 h后棄染液，加入NaCl溶液(0.06 %，w/v)，沖洗3～5次，向平板中加入足量的NaCl溶液1 h，測定透明圈直徑(H)，計算H/C值。

1.4 產纖維素細菌鑒定

將初篩中能形成水解圈的菌株接種至牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15～25 g、蒸餾水 1000 mL，pH 7.4～7.6)中，28 ℃、200 r/min培養至OD=0.8，分別取1 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清，用天根細菌基因組提取試劑盒提取總DNA，用Nano Drop OD 2000C檢測DNA濃度和純度，-20 ℃保存備用。分別以菌株基因組總DNA為模板，用細菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R[7]擴增16S rRNA基因序列，電泳檢測合格后送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。分別將序列通過GenBank比對并選取參考序列，用MEGA 7.0[8]構建系統發育樹，并根據系統關系確定分類地位。

1.5 纖維素酶活力測定

1.5.1 粗酶液制備 分別將待測菌株接種至15 mL發酵培養基(羧甲基纖維素鈉5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蒸餾水 l 000 mL)中，28 ℃、220 r/min振蕩培養3～4 d，6000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.5.2 纖維素酶活力測定 (1)葡萄糖標準曲線繪制:配制1.0 mg/mL的葡萄糖溶液作為標準葡萄糖母液，將母液分別稀釋為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的葡萄糖溶液于5 mL離心管中，分別取2 mL，并分別加入1mL DNS溶液(酒石酸鉀鈉182 g、3,5-二硝基水楊酸6.3 g、NaOH 21 g、苯酚 5 g、亞硫酸鈉5 g、蒸餾水1000 mL)，沸水浴煮沸10 min，冷卻，補加21.5 mL蒸餾水。分別在波長540 nm用分光光度計測定吸光值，并繪制葡萄糖標準曲線。

(2)菌株纖維素酶活力測定:濾紙酶活測定:將新華1號濾紙剪成1 cm×3 cm的小條，卷成小卷后置5 mL 試管內，分別加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH = 4.8) 1.75和0.25 mL酶液，搖勻，使濾紙完全浸泡在液體中，將試管置于50 ℃水浴1 h，加入1 mL DNS試劑，沸水浴10 min后置冷水中冷卻。用酶標儀測定吸光度值，波長為540 nm。內切酶酶活測定:取含有0.5 %羧甲基纖維素鈉的醋酸緩沖液1.75 mL加入5 mL 試管中，加入酶液0.25 mL，將EP管放入50 ℃水浴0.5 h，加入1 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷水冷卻。用酶標儀測定吸光度值，波長為540 nm。外切酶酶活測定:取含有0.5 %微晶纖維素的醋酸緩沖液1.75 mL加入5 mL試管中，加入酶液0.25 mL，于50 ℃水浴2 h后，加入1 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷水冷卻。用酶標儀測定吸光度值，波長為540 nm。

(3)酶活力計算:酶活力定義：在50 ℃條件下，1 mL粗酶液在1 min內水解底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個纖維素酶酶活力單位(U/mL)[9-11]。

1.6 高效菌株發酵條件的優化

1.6.1 培養基pH對產酶的影響 分別配制pH為4、5、6、7、8、9的羧甲基纖維素鈉液體培養基，分別接種高效菌株，于28 ℃、200 r/min培養3 d后測定纖維素酶活力，確定最佳pH。

1.6.2 碳源對產酶的影響 配制最佳pH條件，含0.25 %、0.5 %、0.75 %、1.0 %、1.25 %羧甲基纖維素鈉的羧甲基纖維素鈉發酵培養基，分別接種高效菌株，于28 ℃、200 r/min培養3 d后測定纖維素酶活力，確定最佳碳源濃度。

表1 產纖維素酶菌株初篩結果Table 1 Primarily screening results for cellulase producing strains

表2 纖維素酶活力測定結果Table 2 Results of cellulase activity

1.6.3 氮源對產酶的影響 分別配制最佳pH條件、最佳羧甲基纖維素鈉濃度、含0.25 %、0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %的NaNO3的羧甲基纖維素鈉發酵培養基，分別接種高效菌株，于28 ℃、200 r/min培養3 d后測定纖維素酶活力，確定最佳氮源濃度。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶細菌的篩選鑒定

從分離平板上分別挑取不同形態的細菌及放線菌，根據單菌落大小、形態、顏色最終選定51株菌。經剛果紅染色初篩，有15株細菌形態菌株、3株放線菌形態菌株產生透明水解圈。其中9株菌的水解圈最明顯(表1)。透明圈直徑/菌落直徑最大的是菌株L43和zy004，比值達4.0。雖然透明圈直徑/菌落直徑比值直接反映了酶濃度的高低，但其不能作為菌株酶活的唯一定量指標，所以有必要對這些菌株進一步進行產酶酶活測定。

2.2 纖維素酶活力測定結果

葡萄糖標準曲線如圖1所示，根據標準曲線構建了線性回歸方程。對在羧甲基纖維素鈉培養基上有較大水解圈的菌株分別測定濾紙酶活、內切酶酶活、外切酶酶活，結果如表2所示。其中菌株L43的濾紙酶活最高，達8.53 U/mL，其外切酶酶活最高，達20.17 U/mL。綜合初篩和酶活測定結果，菌株L43的纖維素酶活力最高。

2.3 產纖維素酶菌株系統發育地位確定

分別擴增并測定了9株產纖維素酶菌株的16S rRNA基因序列，并分別在GenBank中比對以獲取同源序列。從系統發育樹(圖2)和相似性分析表明，zy001與StenotrophomonaspavaniiLMG 25348T相似性最高99.9 %，命名為Stenotrophomonassp. zy001；zy002與PantoeadispersaDSM 30073T相似性最高99.6 %，命名為Pantoeasp. zy002；zy003與EnterobacterludwigiiEN-119T相似性最高為99.9 %，命名為Enterobactersp. zy003，zy004與NovosphingobiumgossypiiJM-1396T相似性最高為99.6 %，命名為Novosphingobiumsp. zy004，zy005與StreptomycesalbolongusNBRC 13465T相似性最高為99.9 %，命名為Streptomycessp. zy005；zy006與StreptomycesdiastaticusNBRC 15402T相似性最高為99.9 %，命名為Streptomycessp. zy006；zy007與PseudomonastaiwanensisBCRC 17751T相似性最高為98.4 %，命名為Pseudomonassp. zy007；zy008與PseudomonastaiwanensisBCRC 17751T相似性最高為99.9 %，命名為Pseudomonassp. zy008；L43與LuteibacterrhizovicinusLJ96T相似性最高為97.5 %，命名為Luteibactersp. L43。9株纖維素酶活力較高的菌株屬于7個屬，其中L43與參考菌株相似性最低，是該屬的一個潛在新種。

圖1 DNS比色法測定葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose based on DNS colorimetric method

圖2 根據16S rRNA構建的產纖維素酶菌株的系統發育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of cellulase producing bacteria

圖3 pH對纖維素酶的影響Fig.3 The effect of pH on cellulase

2.4 高效菌株L43發酵條件優化

這9株產纖維素酶較高的菌中，L43酶活最高，所以選擇該菌進行發酵產酶條件優化。如圖3所示，pH對該菌的纖維素酶活力有一定影響，在pH 6的發酵培養基中纖維素酶酶活最高。

如圖4所示，在pH 6的發酵培養基中當羧甲基纖維素鈉為1.25 %時，纖維素酶活力最高。

配制pH 6、羧甲基纖維素鈉為1.25 %的不同氮源(NaNO3)濃度的發酵培養基，酶活測定表明在羧甲基纖維素鈉為0.5 %時纖維素酶活力最高(圖5)。在發酵培養基pH 6、羧甲基纖維素鈉濃度為1.25 %、NaNO3濃度為0.5 %時纖維素酶活力最高，濾紙酶活達(16.9±1.61)U/mL，外切酶酶活達(39.62±1.65)U/mL。

圖4 碳源濃度對L43纖維素酶的影響Fig.4 The effect of carbon source concentration on cellulase

圖5 氮源濃度對L43纖維素酶的影響Fig.5 The effect of nitrogen source concentration on cellulase

3 討 論

本實驗用羧甲基纖維素鈉培養基從自然發酵的煙草秸稈堆肥腐熟物中選擇性分離出能產纖維素酶的51株菌，從形態上分為細菌及放線菌。經過剛果紅染色初篩，篩選到9株透明圈較大、產纖維素酶活力較高的菌株。經16S rRNA序列分析將這些菌為7個屬。其中纖維素酶活力最高的菌株L43與參考菌株L.rhizovicinusLJ96T相似性較低，為Luteibacter的潛在新種。通過單因素試驗明確發酵培養基的pH、碳源濃度、氮源濃度對纖維素酶活力的影響，并篩選出最優的發酵培養基：羧甲基纖維素鈉12.5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO35 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蒸餾水 l 000 mL、pH 6。其最高酶活為濾紙酶活：16.9 U/mL，外切酶酶活：39.62 U/mL，培養基優化后濾紙酶活提高了，所分離的產纖維素酶活力較高的細菌及放線菌的外切酶酶活較高，但所有菌株的內切酶酶活較低。試驗結果為高效菌株L43的纖維素酶利用提供了理論基礎。

產纖維素酶菌株在自然界中分布廣泛，作為纖維素生物質的分解者，在自然界中植物秸稈降解物質循環中發揮重要的作用，從煙草秸稈中分離出多種產纖維素酶菌株，為煙草秸稈還田提供了優良的菌株資源。Stenotrophomonas[12]、Pseudomonas[12-13]、Pantoea[14-15]、Enterobacter[13,16]、Novosphingobium[17]、Streptomyces[13]等屬的菌株有纖維素降解活性，也有相關報道。但Luteibacter菌株的報道并不多，目前該屬有效發表的種有3個，其中Luteibacterrhizovicinus分離自大麥根際[18]，從三尖杉根際分離的Luteibactersp.對三尖杉寧堿具有轉化作用[19]，從西沙野生諾尼果成熟果實中也分離到Luteibacter屬的菌株[20]。因此，Luteibacter屬的菌在自然界與植物會有一定的互作關系。有關Luteibacter菌具產纖維素酶活性是首次報道，提供了新的產纖維素酶菌株資源。不同微生物有著不同降解效率[21]，多種菌互作能更有效降解纖維素[22]，因此要重視和加強對多種產纖維素酶菌提高煙草秸稈腐熟的研究。若把混菌發酵技術應用到煙草秸稈堆肥中，將會有效提高煙草秸稈的腐熟效率，對煙草秸稈及其他農作物秸稈類資源的開發應用及環境保護具有重要的意義。

4 結 論

本研究為煙草秸稈腐熟提供了優良產纖維素酶菌株資源，為Luteibactersp. L43的開發利用奠定了基礎。