左旋肉堿和茶多酚對脂多糖誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用及機制比較

許明賢 張潔容 唐瑞娣 喻璽 謝彥 鄒昌業

1中山大學附屬第一醫院骨科（廣州510080）；2廣州醫科大學（廣州510210）

我國是肝病大國，以感染性肝病最為多見。急性肝損傷常由感染、中毒、代謝異常、缺血缺氧等眾多原因導致。嚴重影響肝臟的解毒、合成、生物轉化和排泄等功能甚至失代償發展為肝功能衰竭。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌產生的內毒素，誘導氧化應激和全身炎癥反應可引起肝臟損傷［4-5］，常用于急性肝損傷模型的制備［6-7］。LPS 不但可以加重肝硬化和酒精肝病肝損傷，而且明顯增強乙醇等肝臟毒物的肝毒性［8-9］。茶多酚（tea polyphenol，TP）是從天然植物茶葉中分離提純出來的多酚類化合物的復合體，作為一種常見抗氧化食品添加劑而被廣泛應用于食品加工行業。茶多酚具有抗細胞凋亡并且對缺血再灌注肝損傷、四氯化碳導致的肝損傷和肝纖維化有保護作用［10-11］。肉堿在哺乳動物體內只有左旋體由賴氨酸轉化生成的。左旋肉堿也常作為添加劑應用于食品領域、醫藥、保健等。研究發現，左旋肉堿（L-carnitine，LC）具有促進脂肪酸氧化，調節機體脂質代謝，抗炎抗氧化的功能［12-15］。但是目前現有研究中，對比較左旋肉堿和茶多酚兩種藥物對LPS 誘導的小鼠急性肝損傷的氧化應激和抗炎反應研究尚缺。本實驗通過比較分析茶多酚與左旋肉堿在LPS 誘導的小鼠急性肝損傷中是否有保護效果及兩藥物效果，是否可通過抗炎和抗氧化應激兩方面機制來緩解肝損傷，為臨床診療提供新的藥物借鑒。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物藥品及試劑SPF 級KM 雄性小鼠［體質量（35±3）g，購于中山大學動物中心］。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒，超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒、ALT 測試盒、AST測試盒均購于南京建成生物工程研究所。小鼠TNF-α和IL-1β ELISA 試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。脂多糖（sigma）購于合肥博美生物科技有限責任公司。茶多酚（純度98.06%）購于浙江杭州同發生物科技有限公司。左旋肉堿（純度98%）購于浙江誠達藥業股份有限公司。

1.2 實驗設計40 只雄性SPF 級KM 小鼠隨機分為4 組（n= 10）：假手術組（sham 組）、模型組（LPS組）、左旋肉堿治療組（LC+LPS 組）和茶多酚治療組（TP+LPS 組）。腹腔注射LPS（10 mg/kg）方法復制小鼠急性肝損傷模型，sham 組注射同樣劑量生理鹽水［1］。治療組于術前7 d 開始，持續8 d 分別用左旋肉堿溶液灌胃（500 mg/Kg，qd）［2］和茶多酚溶液灌胃（200 mg/Kg，qd）［3］。造模24 h 后眼球取血，分離血清測定ALT、AST、MDA、SOD、GSH 含量。取出肝臟稱重計算肝臟系數（肝臟質量/小鼠質量×100%），計算稱量后取部分肝臟制備肝臟勻漿并檢測勻漿中炎癥因子TNF-α、IL-1β含量，另取部分肝臟組織做HE 染色切片對比顯微鏡鏡下（10×40）肝組織損傷情況。

1.3 統計學方法用Excel 對實驗數據進行統計整理，然后采用SPSS 17.0 對所得各組數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），方差具有齊性則進一步用LSD-t法進行兩兩比較，方差不齊者則用Dunnett T3 法進行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 左旋肉堿和茶多酚顯著降低LPS 小鼠血清中ALT、AST 含量，左旋肉堿效果更佳與假手術組（sham組）相比，LPS引起小鼠血清ALT、AST含量顯著增加，表明LPS 誘導肝功能損傷模型成功建立（P＜0.05）。左旋肉堿和茶多酚均能明顯降低丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）含量（P＜0.05）。與茶多酚治療組相比，左旋肉堿在降低ALT、AST 含量上效果更好（P＜0.05），對緩解肝肝損傷效果更好。見圖1。

圖1 茶多酚與左旋肉堿改善LPS 引起的肝功能指標改變Fig.1 L-carnitine and Tea polyphenol improve the liver function index changes induced by LPS

2.2 左旋肉堿和茶多酚明顯改善LPS 引起的肝細胞損傷，并降低肝系數小鼠肝組織蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）顯微鏡（400×）下觀察肝細胞形態。假手術組（sham 組）肝組織結構正常，排列整齊，肝細胞形態正常；模型組（LPS 組）肝組織明顯腫脹，排列紊亂，肝竇擴張充血，肝細胞間隙可見炎細胞浸潤并出現出血壞死。左旋肉堿治療組、茶多酚治療組肝組織病理損傷明顯減輕；左旋肉堿治療組與茶多酚治療組比較，兩組切片鏡下觀察肝損傷程度沒有顯著區別。與假手術組（sham 組）相比，模型組（LPS 組）小鼠肝系數明顯增加（P＜0.05）；與LPS 組相比，左旋肉堿和茶多酚明顯降低肝系數（P＜0.05），但左旋肉堿和茶多酚對肝系數的影響差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、3。

圖2 肝臟HE 染色病理切片（400×）Fig.2 Pathological sections of liver stained with HE（400×）

圖3 左旋肉堿和茶多酚對小鼠肝臟系數的影響Fig.3 The effect of L-carnitine and Tea polyphenols on liver index in mice

2.3 左旋肉堿和茶多酚明顯改善LPS 引起的氧化應激反應與假手術組（sham 組）相比，模型組（LPS 組）小鼠血清SOD、GSH 含量顯著降低，MDA含量顯著增加（P＜0.05）；與LPS 組相比，左旋肉堿治療組、茶多酚治療組血清SOD、GSH 含量顯著增加，MDA 含量降低（P＜0.05）；與左旋肉堿治療組相比，茶多酚治療組小鼠血清GSH、SOD 含量顯著升高，血清MDA 含量顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

2.4 左旋肉堿和茶多酚改善LPS引起的炎癥反應與假手術組（sham 組）相比，模型組（LPS 組）肝臟組織中TNF-α、IL-1β含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組（LPS 組）相比，左旋肉堿治療組和茶多酚治療組TNF-α、IL-1β含量顯著降低（P＜0.05）；左旋肉堿治療組肝臟組織中TNF-α、IL-1β含量較茶多酚治療組顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

圖4 左旋肉堿和茶多酚改善LPS 引起的氧化應激指標Fig.4 L-carnitine and tea polyphenols improve the indexes of oxidative stress induced by LPS

圖5 左旋肉堿和茶多酚改善LPS 引起的炎癥反應Fig.5 L-carnitine and tea polyphenols improve the inflammatory response induced by LPS

LPS 誘導的急性肝損傷在臨床上較常見。筆者之前的實驗研究發現，LPS 可以誘導小鼠產生氧化應激與炎癥反應從而導致肝損傷［1］。LPS 與機體炎癥效應細胞表面受體識別病原體表面的抗原，進而激活細胞內MAPKs-NF-κB 信號通路，誘導炎性介質及多種促炎因子的生成和釋放，引發級聯擴大機體炎癥反應［16］。炎癥反應阻礙肝臟微循環，引起肝臟缺血、缺氧和氧化應激等反應，導致肝損傷［17］。血清中ALT 和AST 含量都是臨床常用來衡量肝損傷的重要指標，ALT 與AST 的活力表現了肝臟病理生理情況［18-19］。本實驗中LPS 組中肝組織HE 染色病理切片顯示肝組織明顯腫脹，排列紊亂，肝竇擴張充血，肝細胞間隙模糊可見炎細胞浸潤并出現出血壞死，肝臟系數顯著增加（P＜0.05），小鼠血清中ALT、AST 含量顯著升高（P＜0.05），實驗結果表明腹腔注射LPS 誘導小鼠急性肝損傷顯著。與茶多酚組相比，左旋肉堿組降低血清中ALT、AST 含量更為顯著（P＜0.05），說明左旋肉堿對LPS 誘導的急性肝損傷緩解效果更優越。

MDA、SOD、GSH 均是衡量機體抗氧化的重要指標。MDA 是體內脂質被自由基攻擊所產生的脂質過氧化物，可間接反映氧自由基含量的變化；SOD 是機體重要的超氧自由基清除因子，它通過使氧自由基發生歧化反應，其活力的高低反映了抗氧化和防御自由基損傷的能力；GSH 是機體內最重要的非酶性抗氧化劑和自由基清除劑［20-21］。本研究結果顯示：與假手術組比較，小鼠腹腔注射LPS 導致血清中MDA 含量顯著增加（P＜0.05），SOD 和GSH 含量顯著降低（P＜0.05），表明小鼠腹腔注射LPS 可導致小鼠機體產生明顯氧化應激反應與上述研究結果一致。與模型組相比，左旋肉堿治療組和茶多酚治療組的血清中MDA 含量明顯降低，SOD、GSH 含量明顯升高，表明左旋肉堿和茶多酚均可提高小鼠機體的抗氧化應激能力，通過抵抗LPS 導致的氧化應激反應從而緩解小鼠急性肝損傷。與左旋肉堿治療組相比，茶多酚治療組血清中SOD、GSH 含量顯著升高，說明茶多酚對LPS 誘導的急性肝損傷中抗氧化作用更強（P＜0.05）。茶多酚作為一種天然抗氧化劑，除了可以直接清除活性氧自由基和抑制脂質過氧化外，還可以螯合鐵離子，影響氧化過程的進行以及激活細胞內抗氧化防御系統［22］。左旋肉堿誘導了線粒體ROS 生成減少具有抗氧化應激功能［15］。BODAGHI-NAMILEH 等［23］的研究表明，左旋肉堿可以降低體內MDA 含量，提高SOD 含量，與本研究結果一致。本研究結果提示兩種藥物均具有抵抗LPS 誘導的氧化應激反應能力，均可抑制自由基產生，有利于臨床應用抗氧化藥物提供新的借鑒思路。但其具體機制通路和涉及抗氧化應激相關基因有待進一步研究。

LPS 會導致體內TNF-α，IL-1β等炎癥因子的釋放，炎癥因子IL-1β會激活JAK-STAT 信號通路的磷酸化，繼而損害肝臟［24-25］。TNF-α是通過NF-κB 信號通路而導致肝損傷［26］。在本實驗中，與假手術組比，模型組肝臟組織中TNF-α，IL-1β顯著增加（P＜0.05），結果表明小鼠腹腔注射LPS 誘導機體產生炎癥介質造成急性肝損傷。與模型組相比，左旋肉堿治療組、茶多酚治療組肝臟組織中IL-1β和TNF-α含量均明顯降低，表明左旋肉堿和茶多酚均具有抗炎作用，但左旋肉堿降低炎癥指標的效果明顯優于茶多酚（P＜0.05）。馮亮等［3］的研究表明，茶多酚可以降低酒精性肝損傷細胞內ALT、AST、MDA、TNF-α和IL-1β含量，同時還可以升高血清中SOD、GSH 的含量，與本實驗研究結果一致。實驗結果提示兩種藥物都能通過抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α的產生，緩解LPS 誘導的小鼠急性肝損傷，但是該兩種藥物是否對其他炎癥介質也有抑制生成作用有待進一步研究。

綜上所述，茶多酚、左旋肉堿均可緩解脂多糖誘導的小鼠急性肝損傷，左旋肉堿緩解肝損傷效果更佳。其作用機制與增強機體抗氧化應激和抗炎能力有關，本實驗數據表明左旋肉堿主要通過提高抗炎能力緩解肝損傷，在抗氧化應激方面茶多酚效果更為優越，兩種藥物對緩解LPS 誘導小鼠急性肝損傷具體機制及療效機制比較有待進一步研究。