人工栽培黃花石蒜乙醇提取物HPLC指紋圖譜研究

王 姣 劉 霞 劉湘丹 周日寶*

1. 湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院，湖南 湘潭 411104；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208

黃花石蒜(Lycorisaurea(L’Her.)Herb.)，又名忽地笑，為石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜屬(LycorisHerb.)的多年生草本植物，主要分布在廣西、湖南、貴州、廣東等省地[1]，其鱗莖外包有暗褐色膜質(zhì)鱗被，葉扁長線形，似大蒜，因而得其名。其性味辛、甘、溫，有毒，具有消腫、殺蟲作用[2]。黃花石蒜中含有多種生物堿，如石蒜堿、加蘭他敏、力可拉堿等[3-5]，其中加蘭他敏(Galanth amine)是一種可逆性膽堿酯酶抑制劑，易透過血腦屏障，產(chǎn)生較強的中樞作用，其臨床藥用形式是氫溴酸加蘭他敏，可廣泛用于阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s disease，AD)、重癥肌無力、兒童腦性麻痹癥、多發(fā)性神經(jīng)炎及由于神經(jīng)系統(tǒng)疾病或外傷所引起的感覺運動障礙等癥治療[6-9]。

中藥指紋圖譜的測定方法有很多，其中HPLC法由于具有分離效能高分析速度快等優(yōu)點[10-12], 近期已廣為普及用于中藥的定量分析，在中藥的定性鑒別中亦能發(fā)揮很好的作用[13]。本研究采用HPLC指紋圖譜技術(shù)，以黃花石蒜枯萎初期花為研究對象，建立黃花石蒜醇提物的指紋圖譜，為黃花石蒜的鑒定及內(nèi)在質(zhì)量評價提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260LC高效液相色譜儀，含二元泵、手動進樣器、紫外檢測器、柱溫箱，ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)(安捷倫科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋DK-98-1型(天津市泰斯特儀器有限公司)；電子天平FA2004(上海恒平科學儀器有限公司)；《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)》(國家藥典委員會發(fā)行)。

1.2 材料 10批藥材分別收集于湖南省瀏陽大圍山、南岳衡山、湖南中醫(yī)藥大學藥植園的人工栽培黃花石蒜基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學周日寶教授鑒定為石蒜科(Lilicaeae)石蒜屬(Lycoris)植物黃花石蒜(Lycorisaurea(L’Her.)Herb.)，樣品來源詳見表1。將黃花石蒜花置于60 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過60目篩，備用。

表1 樣品來源

1.3 試劑 加蘭他敏對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，純度為99%)；95%乙醇、鹽酸、甲醇、三氯甲烷、氨水、磷酸均為分析純；重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取加蘭他敏對照品0.00498 g，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得濃度為0.498 mg/mL的對照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黃花石蒜各組粉末約5 g，精密稱定，加95%乙醇50 mL，水浴加熱回流1 h，提取2次，過濾。濾液水浴揮干，殘渣加0.1 mol/L鹽酸25 mL溶解，過濾。濾液加氨水調(diào)pH9.0，然后以三氯甲烷萃取3次，每次25 mL，合并萃取液，水浴揮干，殘渣加甲醇溶解，定容至10 mL，再精密量取1 mL，用甲醇定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液，即得[14-16]。

2.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm,5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(含0.1%磷酸，B)，梯度洗脫見表2；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長：238 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.3 指紋圖譜的方法學考察

2.3.1 精密度實驗 精密吸取同一濃度供試品溶液(2號樣品)10 μL，在“2.2 色譜條件”項下連續(xù)進樣6次，測得各特征色譜峰相對保留時間的RSD值均小于3%，表明實驗儀器的精密度良好。結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗相對保留時間計算結(jié)果

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一濃度的供試品溶液(2號樣品)，分別于制備后0、2、4、6、8、10 h在“2.2 色譜條件”項下進樣10 μL，測得各特征色譜峰相對保留時間的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

2.3.3 重復(fù)性實驗 取同一供試品(2號樣品)平行制備5份樣品溶液，分別精密吸取 10 μL并在“2.2 色譜條件”項下進樣，測得各特征色譜峰相對保留時間的RSD值均小于3%，表明本測定方法的重復(fù)性良好。結(jié)果見表5。

表4 穩(wěn)定性試驗相對保留時間計算結(jié)果

表5 重復(fù)性實驗相對保留時間計算結(jié)果

2.4 對照品溶液測定 取對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按“2.2 色譜條件”項下測定，記錄色譜圖，即得對照品色譜峰圖，見圖1。

2.5 樣品測定 取供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按“2.2 色譜條件”項下測定，記錄HPLC色譜圖(見圖2)。在供試品色譜圖中，以加蘭他敏色譜峰6號(S峰)的保留時間和色譜峰面積為1，計算各指紋峰的相對保留時間，結(jié)果見表6。

表6 人工栽培黃花石蒜10批樣品共有峰相對保留時間

共有峰S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10AVERAGERSD/%10.68080.68580.68440.68930.68510.68300.68240.64160.68580.68580.68042.1320.76350.76590.76640.76540.76280.76280.76230.75660.76390.76590.76360.3730.89420.89730.89550.89710.87760.89360.89340.89370.89120.89530.89290.6440.91540.91790.91390.91980.91610.91410.91390.91000.91790.91580.91550.2950.98270.97950.97750.98350.97750.97750.97750.97340.97950.97950.97890.2961.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0071.03601.04721.04301.04731.04291.04291.04101.03681.04311.04311.04230.3281.14231.20331.20081.20581.19631.19841.20291.20041.20531.20531.19611.6091.49981.51331.51021.51851.50921.51121.51231.50511.51541.15131.47462.75101.53271.62421.62091.62551.61761.61961.62091.61961.62421.62421.61291.75111.59621.68171.68241.68931.68101.67881.68241.68101.68791.68171.67421.65121.76541.86651.86071.87451.85891.86301.87091.86301.86861.87061.85621.74131.84181.99381.99181.99791.98571.98361.99181.98771.99181.99561.97622.40

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 指紋圖譜的建立及共有峰的確定 根據(jù)供試品溶液測定結(jié)果，采用相對保留時間標定指紋圖譜，記錄50 min的色譜圖，以加蘭他敏為參比物(S)，將各指紋圖譜保留時間與同一圖譜中參照物的保留時間(設(shè)定為1)比較，其比值為各指紋峰的相對保留時間。計算10批藥材指紋圖譜中各指紋峰的相對保留時間(見表6)，確定了13個共有特征峰(見圖3)，其中6號特征為參比色譜峰。

圖3 黃花石蒜花的HPLC樣品對照圖譜圖

表7 人工栽培黃花石蒜10批藥材相似度結(jié)果

2.6.2 不同生長年限及不同產(chǎn)地的黃花石蒜花的相似度評價 將各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)文件以AIA格式輸出，應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)》對其進行處理，并以10批供試品品生成的對照圖譜(中位數(shù)法)作為對照模板，通過自動匹配，計算得出各色譜圖的整體相似度介于0.917～0.996之間(見表7)，表明10批藥材具有較高的相似度。

3 討論

根據(jù)黃花石蒜前期研究[17]，黃花石蒜不同器官中加蘭他敏含量測定結(jié)果，花中各器官加蘭他敏含量高低依次為： 花>根>花葶>鱗莖，提示黃花石蒜中加蘭他敏含量主要集中在花中，其含量遠遠高于其傳統(tǒng)入藥部位地下鱗莖。長期以來一直采挖地下鱗莖導致了野生資源瀕臨枯竭、生態(tài)環(huán)境嚴重破壞、藥材原料供應(yīng)緊張。采收人工栽培黃花石蒜的花作為原料可以有效保護瀕臨枯竭的野生資源和生態(tài)環(huán)境，確保資源的可持續(xù)利用。同時，黃花石蒜為多年生宿根植物，每年都可以采收花，種植效益高，受益時間長，生產(chǎn)成本低，采收勞動強度小等優(yōu)勢。黃花石蒜花的最佳采收期研究中確定了盛花期及其后的枯萎期是人工種植的最佳采收期[18]。故本研究對象采用黃花石蒜枯萎初期的花。

從表6樣品指紋峰相對保留時間計算結(jié)果可以看出，其共有峰相對保留時間RSD值介于0.00%～0.29%之間，且均小于0.3%，沒有明顯差異；根據(jù)表7人工栽培黃花石蒜10批藥材相似度結(jié)果整體來看，相似度結(jié)果均在0.9以上，具有較高的相似度。因此，可以說明不同生長年限及不同產(chǎn)地的黃花石蒜花的指紋圖譜成分具有一致性。通過本研究確立了13個特征峰，其中6號參照峰為加蘭他敏，其結(jié)果與文獻[19]報道基本一致。

通過采用HPLC技術(shù)，并以加蘭他敏為參比物建立了黃花石蒜花的醇提取物的HPLC指紋圖譜，該方法操作簡便，結(jié)果準確，為更快速的鑒別藥材，并有效地控制黃花石蒜花的內(nèi)在質(zhì)量，保證藥材、中藥飲片及其中藥制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性提供了科學依據(jù)。