白洋淀典型抗生素與底棲藻類群落指標相關性研究

張璐璐，申立娜，張玲菲，秦珊，姚波,2，崔建升,2

1. 河北科技大學環境科學與工程學院，石家莊 050000 2. 河北省污染防治生物技術實驗室，石家莊 050000

抗生素可分為磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內酯類、聚醚類、β-內酰胺類、林可霉素類、氯霉素類、多肽類、氨基糖苷類及其他種類[1-2]，其具有水溶性、耐降解或轉化、化學結構和作用機理復雜等特點[3]，在不同的pH條件下可呈現為中性、陽離子、陰離子或兩性離子[1]。近幾十年來，抗生素被廣泛應用于人類醫療和獸藥中，并在牲畜和水產養殖中使用量頗大[4]。2017年中國抗生素消費量高達12萬t[5]，其中約有84 240 t抗生素用于獸藥[6]。而抗生素進入機體后不能被完全吸收，約90%隨糞便或尿液以母體化合物或代謝物的形式排出[7]，最終進入水環境。來源于醫療、畜禽和水產養殖等的抗生素直接或間接進入污水處理廠，而污水處理廠對于喹諾酮類抗生素的去除效率僅有9.35%～26.96%[8-10]，抗生素最終隨污水處理廠出水排放進入環境[11]。研究表明，抗生素在地表水[12-21]、地下水[22]、飲用水[23]和海洋[24]中均被檢出，因此越來越多的研究者開始關注其對水生態系統的生態效應。

河北省作為我國制藥大省，擁有華北制藥、石家莊制藥、神威藥業和以嶺藥業等眾多大型制藥企業[25-26]。此外，河北省人口密集，抗生素的消費量隨經濟快速發展也顯著增加，使得大量未經有效處理的含抗生素廢水、生活污水排入水環境中，加劇了河北省水環境中抗生素的污染形勢[27-28]。白洋淀作為河北省內最大的潛水草型湖泊，由于當地自然條件限制和經濟快速發展，使得白洋淀面臨著污染負荷嚴重的問題[29-30]。除上游的保定市中含抗生素的城市污水和生活廢水經府河進入白洋淀外[31]，大淀周圍的眾多水產養殖使用含抗生素獸藥，也造成白洋淀抗生素的嚴重污染[21,32]，其中，喹諾酮類抗生素(quinolones, QNs)尤為嚴重。

底棲藻類作為湖泊中主要的生產者，為其他水生生物提供營養，其對抗生素也比較敏感[33]，然而，目前研究者多關注抗生素的時空分布、風險值及其源解析[34]，而對抗生素和底棲藻類的相關性研究較少。因此，為研究QNs和底棲藻類群落結構和功能指標的相關性，本研究主要考察：(1)解析白洋淀典型抗生素QNs的時空分布特征；(2)評價白洋淀QNs生態風險；(3)分析底棲藻類群落結構和功能指標；(4)建立QNs生態風險與生物群落結構和功能指標相關關系。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 研究區域

白洋淀(38°44'N～38°59'N，115°45'E～116°06'E)位于我國河北省保定市雄安新區，其占地面積約366 km2，水深范圍為2～6 m，由143個大小不一的淀泊組成，周圍與36座村莊相連。隨著人口增加和經濟增長，白洋淀生態環境不斷惡化，多種污染物在白洋淀內被檢出，如持久性有機物、重金屬等。此外，由于水產養殖廢水和生活污水直接排放，白洋淀內普遍存在抗生素的污染。

1.2 水樣采集與理化特征

本研究設定了8個采樣點(圖1)，分別于2017年4月、8月和11月在各采樣點采集水樣，并按照前人研究的方法進行采樣[30]。部分理化參數包括溫度(temperature, T)、透明度(transparency, Trans)、水深(water depth, WD)、pH值和溶解氧(dissolved oxygen, DO)在采樣時進行測定，其他參數包括總氮(total nitrogen, TN)、總磷(total phosphorus, TP)和化學需氧量(chemical oxygen demand, CODMn)等根據標準方法[35]在實驗室測定(表1)。所有樣品標記好在24 h內運回實驗室，并于-20 ℃的暗處冷凍保存，待實驗測定。

1.3 典型抗生素的分析方法

根據研究可知[36]，喹諾酮類抗生素(QNs)普遍存在于沉積物(65.50～1 166.00 μg·kg-1)和水生植物中(8.37～6 532.00 μg·kg-1)，因此，本研究選取QNs作為白洋淀目標抗生素。環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、丹諾氟沙星(danofloxacin, DAN)、依諾沙星(enoxacin, ENO)、恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)、氟羅沙星(fleroxacin, FLE)、氟美喹(flumequine, FLU)、馬波沙星(marbofloxacin, MAR)、諾氟沙星(norfloxacin, NOR)、氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、奧比氟沙星(orbifloxacin, ORB)、惡喹草酸(oxolinic acid, OXO)、吡哌啶酸(pipemidic acid, PIP)和沙氟沙星(sarafloxacin, SAR)均取自Sigma-Aldrich(Steinheim, Germany)，所有試劑均屬于分析純(純度>95%)。此外，同位素標記的化合物danofloxacin-d5用作內標。

本研究采用利用超高效液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS/MS)測定QNs的濃度。使用Agilent 1200系列HPLC系統(Agilent, Palo Alto, USA)，通過Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)實現QNs的分離。流動相A為0.1%的甲酸水溶液(V/V)，流動相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液(V/V)，其流速為0.3 mL·min-1，控制溫度為40 ℃，進樣量為5 μL，干燥氣體溫度為350 ℃。在配備電噴霧離子化源(ESI+/ESI)的Sciex API 4000三重四級桿質譜儀(美國應用生物系統公司)上進行了測量，氣體溫度為350 ℃，流速為12 L·min-1，霧化器壓力為45 psi，毛細管電壓為-3 500 V(負模式)、+4 000 V(正模式)，加速電壓為4 V。

本研究采用內標法定量。配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg·mL-1的抗生素標準溶液，并設空白組。標準曲線的相關系數范圍為0.992～0.999。QNs的回收率為73%～110%，實驗的相對標準偏差為3.40%～14.50%。以信噪比為10的濃度計算的定量限(LOQs)為0.05～0.20 ng·L-1，信噪比為3的最低檢出限(LODs)為0.02～0.08 ng·L-1。

圖1 白洋淀采樣點分布圖注：S1.府河入淀口、S2.南劉莊、S3.王家寨、S4.燒車淀、S5.棗林莊、S6.圈頭、S7.采蒲臺、S8.端村。Fig. 1 The sampling sites of Lake Baiyangdian in this studyNote: S1. Fuhe inlet, S2. Nanliuzhuang, S3. Wangjiazhai, S4. Shaochedian, S5. Zaolinzhuang, S6. Quantou, S7. Caiputai, and S8. Duancun.

1.4 底棲藻類的采集與分析方法

在各采樣點采集底棲藻類樣品，收集方法參考前人的研究[30]。將采集的底棲藻類樣品分為2份：一份加入0.5 mL 5%的福爾馬林溶液進行成分分析，另一份保存于塑料瓶中進行計量分析。其生物指標包括藻密度(algal density, AD)、葉綠素a(chlorophyll a, Chl a)、葉綠素b(chlorophyll b, Chl b)、葉綠素c(chlorophyll c, Chl c)、葉綠素b/a(chlorophyll b/a, Chl b/a)、葉綠素c/a(chlorophyll c/a, Chl c/a)、硅藻比例(BAC)、綠藻比例(CHL)、藍藻比例(CYA)、堿性磷酸酶(APA)、β-葡萄糖苷酶(GLU)、亮氨酸氨基肽酶(LEU)、多糖含量(PSC)、無灰干重(AFDW)和一般初級生產力(GPP)[30](表2)。

1.5 生態風險評估方法

根據歐盟委員會的技術指導文件[42]和已有研究[43]，對QNs的生態風險進行了評估。本研究利用風險商值法(RQ)計算了底棲藻類的QNs生態風險，該值由實測環境濃度(MEC)與預測無效應濃度(PNEC)的比值求得，其中PNEC由L(E)C50與安全系數(f=1 000)的比值計算求得，具體計算方法如下：

RQ=MEC/PNEC=MEC/(L(E)C50/f)

(1)

根據Hernando等[45]的分類方法，將生態風險分為3個層次：低風險水平(RQ<0.1)、中等風險水平(0.1

1.6 統計分析

根據水質理化特征，通過聚類分析將8個采樣點進行分類。對白洋淀QNs的生態風險水平與底棲藻類的結構和功能指標進行Spearman相關性分析，建立兩者之間的相關關系，顯著性水平分別為P<0.05和P<0.01。聚類分析和相關性分析采用SPSS 16.0統計分析軟件。利用ArcGIS軟件對白洋淀QNs進行時空分布描述，繪制其時空分布圖，QNs的生態風險時空分布熱點圖用Origin繪制。

表1 白洋淀水體理化參數特征Table 1 The chemical and physical attributes in water for Baiyangdian Lake, China

表2 底棲藻類群落的結構和功能指標Table 2 The structure and functional metrics based on the periphyton community

注：D630、D647、D664和D750分別為630、647、664和750 nm處的吸光度；Ve為萃取容量；A為底質表面積；d為比色管的光學長度。

Note: D630, D647, D664 and D750 are the absorption of the extraction at 630, 647, 664 and 750 nm, respectively; Ve is the constant volume of extraction;A is the area of substratum surface; d is the optical length of the cuvette.

為確定QNs對解釋底棲藻類指標變化的相對重要性，使用CANOCO 4.5版本軟件對方根轉化的豐度數據進行了冗余分析(RDA)[46]。RDA分析前進行了去趨勢關聯分析(detrended correlation analysis, DCA)，發現總梯度長度小于標準差達3個數量級，說明環境變量與物種豐度和密度數據之間存在線性關系。為在分析中只保留重要的環境變量，選擇蒙特卡羅排列試驗(999個排列，P<0.05)。

表3 各喹諾酮類抗生素(QNs)對不同營養級的急性毒性(L(E)C50)Table 3 Acute toxicity (L(E)C50) used for the risk assessment of quinolones (QNs) for fish, invertebrate and algae

注：LC50表示半數致死濃度，EC50表示半數效應濃度，PNEC表示預測無效應濃度。

Note: LC50stands for median lethal concentration; EC50stands for concentration for 50% of maximal effect; PNEC stands for predicted no effect concentration.

2 結果(Results)

2.1 白洋淀理化特征及其生境劃分

根據水體理化參數特征，采用聚類分析的方法，將8個采樣點分為3個生境：生境1(S1、S2)代表受城市污水影響；生境2(S3、S6和S8)代表受養殖廢水和生活污水影響；生境3(S4、S5和S7)代表人為干擾較少(圖2)。白洋淀水體主要理化參數如圖3所示。

2.2 白洋淀QNs的時空分布

在14種目標抗生素中，有5種QNs被檢出(圖4)，MAR、FLE、OFL、CIP和FLU濃度分別為9.84～82.43、16.11～223.09、32.51～367.70、0.00～77.34和321.64～1 054.38 ng·L-1。QNs濃度呈現明顯的時空變化。就空間分布而言，QNs的最高濃度出現在生境1(1 309.80 ng·L-1)，其次為生境2和生境3；就時間變化而言，4月QNs濃度最高，其次為8月和11月。QNs中以FLU污染(最高濃度為1 054.38 ng·-1)最為顯著，其次為OFL(最高濃度為367.70 ng·L-1)和FLE(最高濃度為223.09 ng·L-1)。

圖2 基于水體理化特征的聚類分析結果Fig. 2 The classify analysis results for sampling sites based on physical and chemical attributes

圖3 白洋淀各生境不同時間的水體理化參數注：圖中理化參數的單位列于表1。Fig. 3 Time course of water physiochemical properties at the different habitats for Baiyangdian Lake, ChinaNote: The unit for each physiochemical property in this figure could refer to Table 1.

生境1和生境2分別受上游城市污水和淀區養殖及周邊生活污水影響較為嚴重，因此其QNs污染較為嚴重，人為干擾較少的生境3則QNs污染較小[21,32,34]；QNs的濃度為4月>8月>11月，其原因可能是4月開始上游的保定市有大量城市污水排入淀內，再加上處于畜禽和水產品的繁殖期，大量含抗生素的獸用藥物的投加，使得4月QNs濃度最高；到8月份，隨著降水量的增大，地表徑流量增大，使淀內水量大幅度增加，QNs的濃度有所降低；到11月，因畜禽和水產養殖處于淡季，獸用藥物投加量有所下降，再加上夏季大量水草繁殖生長，沉積物和水體中的QNs被吸收和吸附，從而使得QNs濃度大幅度降低。由此可知，白洋淀上游的城市污水及周邊養殖是QNs的主要來源，因此應加強對上游城市污水的QNs處理效率，做好來水的監測工作，嚴格管控獸藥的使用。

2.3 白洋淀QNs生態風險時空分布

MAR、FLE、OFL和CIP在白洋淀的生態風險水平較低(RQ值為0.0000～0.0020)，FLU(RQ值為0.1704～0.5378)處于中等風險水平。其中，生境2的生態風險最高(RQFLU最大值為0.5378)，其次為生境1(RQFLU最大值為0.3153)和生境3(RQFLU最大值為0.2980)(圖5)。QNs的時空分布特征表明，生態風險與人為干擾程度存在直接關系。

圖4 白洋淀中QNs時空分布注：QNs濃度單位為ng·L-1。Fig. 4 The spatial and temporal distribution of QNs in surface water of Baiyangdian LakeNote: The unit of QNs concentration is ng·L-1.

圖5 白洋淀中QNs生態風險的時空分布注：RQs為風險商值。Fig. 5 The spatial and temporal variation of ecological risk of QNs in waterNote: RQs stands for risk quotient.

2.4 底棲藻類群落結構和功能指標時空分布

調查期間測定的AD范圍為(15.31±1.78)～(78.98±18.45) (104cells·cm-2)；Chl a、Chl b、Chl c、Chl b/a和Chl c/a的濃度范圍分別為(0.03±0.01)～(0.22±0.02)、(0.01±0.00)～(0.14±0.03)、(0.01±0.00)～(0.12±0.05)、(0.05±0.02)～(0.39±0.04)和(0.18±0.03)～(0.68±0.08) μg·cm-2；BAC、CHL和CYA的范圍分別為(5.67%±0.76%)～(24.32%±3.42%)、(36.12%±3.41%)～(60.42%±6.57%)和(29.18%±2.34%)～(40.91%±3.89%)；APA、GLU和LEU的范圍分別為(0.32±0.10)～(1.52±0.22)、(0.14±0.08)～(2.89±1.14)和(0.75±0.23)～(5.67±1.08) nmol·cm-2·h-1；PSC和AFDW的范圍分別為(0.06±0.02)～(0.25±0.03) mg·cm-2和(158.65±43.21)～(809.65±212.43) μg·cm-2。AD、Chl a、Chl b、Chl b/a、CHL、CYA、APA、GLU、LEU和AFDW等指標在生境2中最高，而其他指標在生境3中最高，且大部分指標在8月始終最高(表4)。

生境2主要受淀區周邊養殖廢水和生活污水的影響，其偏中-富營養化和富營養化狀態，因此其底棲藻類群落結構和功能指標較高[47]；11月的水污染水平相對于4月和8月較低，抗生素可影響藻類的光合作用，而11月QNs濃度較低，對底棲藻類的抑制作用較小，因此，白洋淀底棲藻類群落指標在11月最高。

2.5 白洋淀QNs生態風險與底棲藻類群落指標相關性分析

通過斯皮爾曼(Spearman)相關性分析，建立了底棲藻類指標與QNs的生態風險之間的關系。表5即底棲藻類指標與QNs的生態風險之間的Spearman相關系數。結果表明，AD、Chl a、Chl b、Chl c、Chl b/a與RQCIP、RQFLU呈顯著相關，其中Chl a與RQFLU顯著相關(r = 0.827，P<0.01)，RQMAR與PSC呈顯著負相關(r = -0.670，P<0.05)，RQCIP與APA(r = 0.721，P<0.05)、LEU(r = 0.715，P<0.05)和AFDW(r = 0.727，P<0.05)呈顯著性相關。在QNs抗生素的風險值中，RQFLU最高，與AD、Chl a、Chl b、Chl c、Chl b/a、Chl c/a、BAC和CHL等結構指標均顯著相關。結構指標與功能指標相比，其與生態風險的相關性較高。

本研究選取底棲藻類群落結構和功能指標進行RDA分析，其特征值為0.990和0.008，解釋了底棲藻類指標數據中99.8%的方差(圖6)。LEU和AFDW與坐標軸1的相關性最大。軸1與RQCIP呈顯著正相關(r =0.7294，P<0.05)，將其解釋為與城市污水相關。BAC和Chl c/a與軸2相關。軸2與RQFLU呈顯著正相關(r =0.8884，P<0.01)，其來源之一可能為水產養殖。此外，抗生素與底棲藻類指標存在顯著的時間差異，因此應重視抗生素與底棲藻類的季節變化。

3 討論(Discussion)

歐盟《水架構指令》指出，建立生態系統與污染物之間的關系是一項重要工作[48]，因此，越來越多的研究者開始關注生物群落的組成，尤其是底棲生物群落的生物學指標[49]。然而，目前關于抗生素與底棲藻類結構和功能指標的相關性的研究較少[34]。一些研究預測，抗生素會對底棲藻類產生不同的影響[50-55]，相關研究結果表明，抗生素對硅藻有明顯的抑制作用，而抗生素對蛋白核小球藻和淡水綠藻的生長則表現為“低促高抑”[51-52,55]，而其余11種常見的底棲藻類不受抗生素的影響[56]。本研究首次探討了QNs對湖泊底棲生物群落的影響，其結果與上述預測相符，如BAC與RQFLU呈顯著負相關(r=-0.782，P<0.01)；CHL與RQFLU呈顯著正相關(r=0.764，P<0.05)，表明BAC和CHL受抗生素影響，而CYA不受其影響，突出了不同抗生素對底棲藻類群落的不同影響。

圖6 基于底棲藻類指標的冗余分析(RDA)注：底棲藻類指標(黑色箭頭)與坐標軸的相關性為-0.6～1.2，環境變量(紅色箭頭)與坐標軸的相關性為-1.0～1.0；1表示4月生境1，2表示4月生境2，3表示4月生境3；4表示8月生境1，5表示8月生境2，6表示8月生境3；7表示11月生境1，8表示11月生境2，9表示11月生境3。Fig. 6 Correlation biplots for the first and second axes of the redundancy analysis (RDA) based on the periphyton metricsNote: The scale is -0.6 to 1.2 for correlations of the periphyton metrics (black arrows) with the axes and -1.0 to 1.0 for correlations of the environmental variables (red arrows) with the axes; the abbreviation codes for the biological metrics refers to Table 2; 1 means Habitat 1 in April, 2 means Habitat 2 in April, 3 means Habitat 3 in April; 4 means Habitat 1 in August, 5 means Habitat 2 in August, 6 means Habitat 3 in August, 7 means Habitat 1 in November, 8 means Habitat 2 in November, and 9 means Habitat 3 in November.

表4 白洋淀底棲藻類結構和功能指標的時空變化Table 4 Time course of periphyton structural and functional metrics at the different habitat for Baiyangdian Lake, China

表5 生物指標與風險值的Spearman相關系數Table 5 The Spearman’s correlation coefficients between biotic metrics and risk indexes

注：*在0.05級別，相關性顯著；**在0.01級別，相關性顯著。

Note: *Correlation level at 0.05, **correlation level at 0.01.

不同的藻類對QNs的敏感性存在一定差異，其原因有藻類細胞的大小和種間競爭。體積較小的藻比體積大的更為敏感(硅藻體積小，比表面積大，因此硅藻對QNs比綠藻更敏感)。此外，由于營養物質和其他資源的種群間競爭，硅藻數量的降低使得綠藻優勢增加。

QNs的最高濃度出現在生境1(1 309.80 ng·L-1)，其次為生境2和生境3，上游含抗生素的城市污水的排入，使得生境1的QNs濃度偏高；生境2的生態風險最高(RQFLU最大值為0.5378)，其次為生境1(RQFLU最大值為0.3153)和生境3(RQFLU最大值為0.2980)，表明生態風險與人為干擾程度存在直接關系，干擾程度較高的地方生態風險則偏高，干擾程度較低的地方生態風險則偏低；AD、Chl a、Chl b、Chl b/a、CHL、CYA、APA、GLU、LEU和AFDW等指標在生境2中最高，而其他指標在生境3中最高，表明藻類的群落結構和功能指標與人為干擾程度呈現負相關性，人為干擾程度低的地方藻類的群落結構和功能指標則偏高。QNs生態風險與底棲藻類群落結構和功能指標相關性結果顯示，與這二者均具有顯著相關性，且底棲藻類的結構指標與QNs生態風險的相關性更為顯著。

綜上所述，白洋淀水體中QNs的使用量、檢出率、濃度和生態風險時空分布均存在明顯的差異性，不同區域QNs的來源也不同；白洋淀底棲藻類群落結構和功能指標也存在明顯的時空分異特征，其主要與水體營養水平、污染程度和光合作用強弱有關；白洋淀底棲藻類群落結構指標與QNs風險值相關性較為顯著，因此，可考慮篩選較為敏感的底棲藻類群落結構指標運用于生態監測，為富營養化湖泊生態監測方法研究提供理論基礎及相關數據支撐。