應用模式生物檢測飲用水源顆粒物的毒性效應

常葉倩，顧翔，喬宇，陳鴻程，李梅,2,*

1. 南京大學環境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京 210023 2. 南京大學環境學院，環境科學與工程國家級實驗教學示范中心，南京 210023

天然水體中廣泛存在的顆粒物，廣義上包括了粒度>1 nm的所有微粒實體。不同粒徑顆粒物在天然水環境中的時空分布不同[1]，自然條件下，同一河流中，水中粒徑<1 μm的顆粒物百分含量高于其他粒徑的顆粒物。這些顆粒物粒徑小，比表面積大，不僅本身是飲用水的重要污染物之一，還可大量吸附水體中的污染物[2]，形成復合污染，從而影響水生生態系統的生物、化學和物理狀態[3]。當水體環境相對靜止時，顆粒物作為污染物的暫時歸宿，可攜帶污染物通過沉降作用沉積于水體底層。一旦環境條件變化或污染物發生物理化學轉化，這些污染物有可能被重新釋放出來，造成環境二次污染[4-6]。

研究表明，粒徑越小，顆粒物越難以通過傳統水處理工藝被去除，其表面吸附的污染物也會隨之殘留在水體中，對飲用水安全產生不利影響[4]。在飲用水處理過程中，主要通過投加無機和有機絮凝劑的方式達到去除顆粒物的目的。戴婕等[7]監測了以長江為原水的常規飲用水處理工藝的出水水質，結果表明，常規水處理工藝對于粒徑>2 μm的顆粒物去除效果較好，出水濁度下降，但出水中仍含有大量粒徑<2 μm的顆粒物，顆粒物總量呈上升趨勢。林濤等[8]研究發現，傳統飲用水處理工藝對小顆粒的去除效果并不理想，出水中仍含有大量的小顆粒(粒徑<1 μm)。已有實驗結果證明，顆粒物可直接或間接影響水生生物[9]。顆粒物常通過物理磨損[10]、干擾水生生物的呼吸[11]和攝入[12]等方式直接影響水生生物。Tse等[13]發現低濃度水體顆粒物暴露即可導致斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)等水生生物出現DNA損傷。此外，由于小顆粒物易與水環境中其他污染物相互吸附、聚集，當其作為食物鏈中某些生物的食物源時，小顆粒物上負載的污染物可進入蝦、魚類等生物體內，進一步通過生物放大作用逐漸富集，最終被人體攝入[4]，產生的健康風險不容小覷[14]。目前，我國還沒有推出傳統飲用水處理工藝對小顆粒物去除效率的相關標準，因此，針對小顆粒物毒性效應的研究有著極其重要的現實意義，研究結果對未來水質指標的制定與優化具有一定指導作用。

淡水單細胞微藻纖細裸藻(Euglena gracilis)培養簡單、生長迅速，其細胞性狀、光合作用等參數對環境脅迫十分敏感，已被廣泛應用于水環境監測評價中[15]。蠶豆(Vicia faba L.)是一種能清晰觀察有絲分裂的植物，其根尖微核試驗常被研究者用作環境致突變性的檢測手段[16]。發光菌(Photobacterium phosphoreum)急性毒性測試方法具有簡便、快速、重現性好以及與其他毒性測試方法所得結果相關性高等優點，是目前應用較多的生物效應檢測技術之一[17]。

本研究以纖細裸藻、蠶豆和發光菌作為受試生物，分別采用生物量、微核率和發光抑制率等作為評價指標，探討飲用水中不同粒徑顆粒物的急性毒性和遺傳毒性效應，以期分析飲用水源不同粒徑區間顆粒物的毒性差異，進而為監測和控制飲用水的毒性并改良飲用水處理工藝提供科學依據，為人類健康及飲用水安全作出貢獻。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 水樣采集與處理

選取南京某水廠進水口上游約2 km的渡口(118°43'9'' E，32°2'1'' N)作為進水采樣點，以江心作為中心點，輻射范圍為50 m的方式設置采樣點，采集水面下0.5 m處水樣。以水廠(118°43'38'' E，32°2'51'' N)附近任一自來水口作為出水點采集，由于距離較近，經管道運輸距離較短，視作直接出水。

分別采集上述進水和出水各2 L作為原水，密封運輸至實驗室4 ℃冰箱保存。使用動態光散射激光粒度儀(Malvern Zetasizer Nano-S，英國)檢測原水中的粒徑分布。根據粒徑分布結果，采用切向流過濾系統(TFF)(SYR2-U20-0LN，美國)，選取孔徑為1 μm的中空纖維微濾膜和具有1 kDa分子量截斷值的膜組件，分別將100 mL進水原水和出水原水進一步分離成粒徑<1 μm顆粒物組(D<1)、粒徑≥1 μm顆粒物組(D≥1)和去顆粒物組。由于本文主要研究飲用水源顆粒物的毒性，無需濃縮顆粒物，故選用相同體積純水(2 L)分散上述分離的顆粒物，所有水樣均置于4 ℃冰箱保存。

1.2 發光菌急性毒性試驗

發光菌(P. phosphoreum)購自中國科學院南京土壤研究所，參考GB/T 15441—1995[18]方法進行急性毒性試驗。

取一定量4 ℃預冷的2% NaCl溶液加入含有發光菌凍干粉的安瓿瓶中，充分混勻，并稀釋至合適濃度作為工作菌液。取各組水樣2 mL加入具塞磨口比色管中，并按0.03 g·mL-1比例加入固體NaCl，以調節水樣滲透壓，同時以2 mL 3% NaCl溶液作為空白對照，取10 μL工作菌液于上述各比色管中，渦旋振蕩均勻，去塞，反應15 min。采用DXY-2型生物毒性測試儀(中國科學院南京土壤研究所制)測試發光強度，空白對照發光強度應控制在600 mV以上。按如下公式計算各組的相對發光抑制率：

相對發光抑制率=(對照管發光強度-樣品管發光強度)/對照管發光強度×100%

(1)

1.3 纖細裸藻急性毒性試驗

1.3.1 微藻培養

纖細裸藻(E. gracilis)藻種由中國科學院水生生物所典型培養物保藏委員會淡水藻類藻種庫(FACHB)提供。采用Checcucci培養基[19]，接種于250 mL三角燒瓶中，在恒溫光照培養箱中活化。培養條件如下：光強80～90 μmol·m-2·s-1，溫度(25±1) ℃，光暗比12 h∶12 h，每天定時人工搖動3～5次，并隨機移動各瓶位置，以減少因光照不同造成的誤差。取培養3 d左右進入對數生長期的微藻，用于后續毒性測試。

1.3.2 微藻生長抑制試驗

生長抑制試驗參考Cheng等[20]的方法進行。取100 mL對數生長期的藻細胞懸液，3 500 g離心15 min，去上清，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞。取各組水樣100 mL置于250 mL錐形瓶中，加入2 mL藻細胞重懸液，于光照培養箱中進行急性毒性試驗，培養條件同上。藻細胞的初始接種濃度約為6×104個·mL-1。采用721-100型紫外分光光度計，于680 nm波長下，以純水作空白對照，分別測定染毒0、24、48、72和96 h的藻液吸光度，結果取3個平行的平均值。為排除水樣自身顏色的干擾，另將未接種微藻的各水樣以相同方法加入96孔板，在相同波長下測定吸光度，結果作為各水樣的本底值。根據本課題組前期研究結果，利用下列公式計算微藻細胞密度[21]：

y=(94.309×OD680+0.9114)×104

(2)

式中：y為細胞密度(個·mL-1)，r=0.999。

1.4 蠶豆根尖細胞微核試驗

蠶豆(V. faba L.)購自江蘇明天種業科技有限公司，席夫氏(Schiff)試劑購自南京森貝伽生物科技有限公司，蠶豆根尖細胞微核試驗參考孔志明[22]的方法進行。將干燥的蠶豆種子于25 ℃恒溫箱中蒸餾水浸泡并催芽若干時間后選種，再次催芽至種子大部分初生根長約1 cm時，選取幼根粗細、長度大致相等的種子作實驗材料。以純水作空白對照，暴露6 h。恢復培養24 h后，從根尖切下1 cm的幼根，卡諾氏固定液固定24 h后，用蒸餾水浸洗根尖2次(每次5 min)，再置于5 mol·L-1鹽酸中，于28 ℃下水解至軟化(約10 min)。采用孚爾根法(Feulgen)染色，以二氧化硫溶液作為洗滌液。處理后換入蒸餾水中，4 ℃保存，供隨時制片用。制片時，將著色完全的根尖細胞1 mm有絲分裂區域放在潔凈的載玻片上，滴少許45% 醋酸溶液，壓片后隨機鏡檢，計數微核細胞數及細胞總數。按如下公式計算微核千分率(micronucleus frequency, MCN, ‰)和綜合污染指數(pollution index, PI)：

MCN=出現微核的細胞數/所觀察的細胞總數×1000‰

(3)

PI=樣品MCN平均值/陰性對照組MCN平均值

(4)

為避免因試驗條件等因素帶來的MCN本底波動，采用PI來劃分所受污染的程度。根據《全國生物技術監測規范——蠶豆根尖微核技術》所規定的污染指數劃分標準：當PI為0～1.5時定為基本沒有污染，PI為1.5～2.0時為輕微污染，PI為2.0～3.5時為中度污染，PI為3.5以上時為嚴重污染。

1.5 數據分析

采用GraphPad Prism 5軟件對處理組和對照組進行顯著性t檢驗，以P<0.05和P<0.01作為顯著性依據。組間差異采用單因素方差分析。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 飲用水源進水和出水粒徑分布

基于探究天然水體中顆粒物毒性效應的目的，本文首先采用動態光散射激光粒度儀對進水原水和出水原水的粒徑分布進行了測定(圖1)，以評估水樣中顆粒的分布情況。動態光散射技術(dynamic light scattering, DLS)指通過測量樣品散射光強度起伏的變化，得出樣品顆粒大小信息的一種技術，一般通過激光粒度儀來實現對樣品顆粒粒徑分布的表征。激光粒度儀可基于激光散射或衍射來分析顆粒的大小[23]。應用動態光散射激光粒度儀對進水原水和出水原水的粒徑分布進行測定，結果顯示，進水中的顆粒物主要由粒徑<1 μm的顆粒物組成，約占顆粒物總量的61.28%；經常規水處理工藝處理后，出水中顆粒物粒徑主要集中于1 μm以下。基于上述結果，本文選用1 μm作為試驗中大、小顆粒的分界。

戴婕等[7]研究發現，以長江為原水的常規飲用水處理工藝出水中濁度雖然下降，但顆粒物總量呈上升趨勢，結合本實驗結果，可認為經常規飲用水處理工藝后，出水中仍含有大量粒徑<1 μm的顆粒物。另有文獻同樣指出，目前，水廠主要去除了>2 μm的顆粒物，降低了濁度，但出水中顆粒物數量明顯增多，且小粒徑顆粒物數量占比較大(約占80%)[8]。張哲等[24]在研究中同樣發現，傳統飲用水工藝對小顆粒的去除效果不顯著，進水和出水中均含有大量小顆粒物(<1 μm)。綜上，可推測濁度與顆粒物數量之間的相關性較差，在現有水處理工藝下，飲用水出水中存在的大量粒徑<1 μm的顆粒物可能威脅人體健康，對于粒徑<1 μm的顆粒物的毒性效應研究迫在眉睫。

2.2 不同粒徑顆粒物對發光細菌急性毒性試驗

發光細菌毒性試驗是快速檢測水體中污染物綜合毒性的有效方法，一般通過測定污染物抑制發光菌發光的程度來評價毒性的大小[25-26]。當接觸到有毒物質時，細菌的熒光素酶會被抑制，光強度迅速下降[27]。本研究首先通過快速、靈敏的發光細菌急性毒性實驗，評估不同粒徑顆粒物的急性毒性效應，以初步確定不同粒徑顆粒物間的毒性差異。

采用切向流過濾系統分別將上述進水原水和出水原水進一步分離成粒徑<1 μm顆粒物組(D<1)、粒徑≥1 μm顆粒物組(D≥1)和去顆粒物組。不同處理組水樣對發光菌(P. phosphoreum)急性毒性測試結果如圖2所示，除D<1組的進水毒性高于出水毒性外，其余處理組的進水毒性均顯著低于出水毒性(P<0.05)。其中，進水原水和出水原水對發光菌的毒性差異最顯著(P<0.01)。氯消毒是飲用水處理中最常用的消毒方式，嵇志遠等[28]應用快速毒性測定儀

圖1 飲用水源進出水中顆粒物分布注：(a). 進水；(b). 出水。Fig. 1 Size distributions of particles in inlet and outlet waterNote: (a). Inlet water; (b). Outlet water.

檢測了水源水和自來水的綜合毒性，發現含氯消毒劑對發光菌具有很強的毒性。因此，在水處理過程中使用含氯消毒劑會影響發光菌的毒性測試結果，表明發光菌不適宜作為水處理后出水毒性檢測的受試生物。此外，由于本研究探討飲用水中不同粒徑顆粒物的急性毒性和遺傳毒性效應，為避免含氯消毒干擾，后續試驗均采用進水處理組水樣。

在進水中，原水對發光菌的急性毒性最強，D<1組對發光菌的急性毒性與原水無顯著性差異，推測進水原水對發光菌的急性毒性或主要由粒徑<1 μm的顆粒物所致。D≥1組對發光菌的急性毒性顯著低于D<1組(P<0.05)，即粒徑<1 μm的顆粒物毒性強于粒徑≥1 μm的顆粒物毒性。劉紅玲等[29]提出大型溞與發光菌作為生物急性毒性試驗的對象可相互取代，且生物致毒機理在一定程度上非常相似。據報道，粒徑<1 μm的顆粒物可能通過攝入或物理磨損的方式影響大型溞的生長、繁殖甚至死亡率[3]。考慮發光細菌的個體大小，推測進水中粒徑<1 μm的顆粒物或可能主要通過物理磨損的方式對發光菌產生毒性效應。

圖2 不同進、出水處理組對發光菌的急性毒性注：D表示顆粒物直徑；D<1表示粒徑小于1 μm顆粒物組；D≥1表示粒徑大于等于1 μm顆粒物組；a、b指示進水和出水組間比較，字母不同表示存在顯著性差異(P<0.01)。Fig. 2 Acute toxicity of different inlet and outlet water treatment groups to P. phosphoreumNote: D indicates diameter; D<1 indicates water sample particles diameter is less than 1 μm; D≥1 indicates water sample particles diameter is more than or equal to 1 μm; a, b indicate that there is a significant difference between the inlet and outlet water groups (P<0.01).

2.3 不同粒徑顆粒物對纖細裸藻急性毒性試驗

藻類生長試驗可用于評價污染物對藻類的短期脅迫效應，進而反映污染物對水體初級生產者的影響。進、出水暴露下，纖細裸藻(E. gracilis)的生長情況如圖3所示。結果表明，與純水對照組(CK)相比，進水和出水均顯著抑制微藻生長(P<0.05)，在24 h處呈現顯著的生長抑制效應(圖3(a))，抑制率分別達11.1%和12.7%，表明2種水樣對微藻均具有生長抑制效應。暴露96 h后進水和出水的生長抑制效應進一步加強，微藻緩慢生長，96 h時的抑制率分別為19.9%和30.0%，出水對微藻的生長抑制效應更為顯著(圖3(b))。

進水不同粒徑顆粒物處理組對纖細裸藻生長的影響如圖4所示。與原水相比，進水不同處理組均可對微藻的生長產生不同程度的影響(圖4(a))。D≥1組的微藻生長速度有減慢的趨勢，D<1組和去顆粒物組微藻的生長速度顯著減慢，即進水D≥1組、D<1組和去顆粒物組均抑制了微藻的生長，其中D<1組和去顆粒物組的抑制效應最顯著(圖4(b))。由實驗結果可得，飲用水源水中，粒徑<1 μm的顆粒物毒性大于粒徑≥1 μm的顆粒物毒性，與發光菌試驗結果一致。3種處理組水樣對藻類的抑制效應均在不同程度上強于原水，其中去顆粒物水的效應最為顯著(圖4(b))，因此，推測進水中或存在不同粒徑顆粒物與水體化合物的拮抗作用，從而降低了原水的毒性效應。Xiao等[3]在貢湖灣水體中也發現粒徑<1 μm的顆粒物水樣對纖細裸藻(E. gracilis)的毒性比粒徑≥1 μm的顆粒物水樣更大。侯秀富[30]對斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)等3種藻類的研究發現，對于相同濃度的不同粒徑顆粒物，小粒徑顆粒物比大粒徑顆粒物對藻類生長的影響更甚。據報道，粒徑<1 μm的顆粒物會限制水體的透光量，影響藻類光合作用[3]，從而影響藻類生長。Kjelland等[11]指出，水體中粒徑<1 μm的顆粒物還可以通過減少水中溶解氧的方式減少浮游生物群落。因此，粒徑<1 μm的顆粒物對纖細裸藻毒性效應的內在機理尚需進一步實驗研究。

2.4 不同粒徑顆粒物對蠶豆遺傳毒性試驗

蠶豆微核試驗是一項短期生物測試，可預測水體污染物的潛在基因毒性[31]。1982年Degrassi和Rizzoni[32]首次建立了蠶豆(V. faba L.)根尖細胞微核試驗系統，并指出微核試驗尤其適用于環境遺傳毒性檢測。根據《全國生物技術監測規范——蠶豆根尖微核技術》所規定的污染指數劃分標準，蠶豆根尖細胞遺傳毒性試驗結果顯示，進水的污染指數(PI≈3.69)顯著高于對照組(PI=1) (P<0.05)，屬于重度污染；出水的污染指數(PI≈2.14)略高于對照組(圖5(a))，屬于中度污染，表明目前的飲用水處理工藝對水中污染物具有一定的處理效果，出水的污染指數顯著減小，但仍具有一定的遺傳毒性。王超等[33]的研究也表明，自來水廠的出廠水具有潛在致突變性。因此，對于飲用水出水的安全性需予以一定的重視。

圖3 進、出水水樣暴露下纖細裸藻的生長狀態注：(a). 生長曲線，(b). 96 h生長抑制率，對照為純水；*表示與對照相比，P<0.05，**表示與對照相比，P<0.01。Fig. 3 Growth state of E. gracilis exposed to inlet and outlet waterNote: (a). The growth curve; (b). The growth inhibition rate of 96 h; Control. Pure water; *indicates P<0.05, compared with control group; **indicates P<0.01, compared with control group.

圖4 不同進水處理組暴露下纖細裸藻的生長狀態注：(a). 生長曲線，(b). 96 h生長抑制率；D表示顆粒物直徑；D<1表示粒徑小于1 μm 顆粒物組；D≥1表示粒徑大于等于1 μm顆粒物組；*表示與原水相比，P<0.05。Fig. 4 Growth state of E. gracilis exposed to different inlet water treatment groupsNote: (a). The growth curve; (b). The growth inhibition rate of 96 h; D indicates diameter; D<1 indicates water sample particles diameter is less than 1 μm; D≥1 indicates water sample particles diameter is more than or equal to 1 μm; *indicates P<0.05, compared with raw water group.

在進水中，D<1組污染指數最高，甚至高于進水原水，屬于重度污染，表明粒徑越小的顆粒物可能吸附的污染物越多，毒性越大。進水的去顆粒物組和D≥1組的污染指數顯著低于進水原水的污染指數，分別屬于輕微污染和中度污染(圖5(b))。由于D<1組污染指數甚至高于進水原水，進水原水的毒性主要由去顆粒物水中的污染物、粒徑<1 μm和粒徑≥1 μm的顆粒物及其相應吸附的污染物組成，故推測污染物與污染物間、污染物與顆粒物間或存在拮抗作用，使污染物和顆粒物的綜合毒性，即進水原水的綜合毒性低于3個處理組毒性的總和。郭長城等[34]選擇76 μm以下的顆粒物進行模擬試驗，發現顆粒物粒徑越小，對污染物的吸附作用越強，因此吸附的污染物可能越多，毒性也越大。朱齊齊等[1]在研究天然水體中顆粒物對7種抗生素的吸附特征時，同樣得出水體中顆粒物粒徑越小毒性越強的結論，并分析這是由小粒徑顆粒物(<1 μm)吸附抗生素能力強所致。據報道，吸附的機理主要有靜電作用、表面絡合作用和競爭吸附等，pH和鈣離子濃度是影響顆粒物吸附的兩大重要因素[35]。任艷婷[36]探究了水環境中不同粒徑顆粒物對喹諾酮類抗生素的吸附特征，結果表明，當pH值為6～8時，粒徑<1 μm顆粒物的吸附能力顯著強于粒徑≥1 μm顆粒物。由實驗測得進水pH約為8.3，因此合理推測在進水中，粒徑<1 μm的顆粒物毒性強于粒徑≥1 μm的顆粒物毒性，或是由粒徑<1 μm顆粒物的強吸附能力所致。

本試驗結果表明，進水中粒徑越小的顆粒物，毒性越大，推測或主要是由于天然水體中(pH=6～8)，粒徑<1 μm顆粒物的吸附能力顯著強于粒徑≥1 μm顆粒物導致。但天然水體中顆粒物誘導發光菌、纖細裸藻和蠶豆根尖毒性效應的具體機理仍有待進一步研究。

綜上所述：

(1)出水中均含大量小顆粒物，特別是粒徑<1 μm的顆粒，表明傳統飲用水處理工藝對這些小顆粒物的去除效果不明顯。

(2)模式生物發光菌不適宜用于飲用水處理工藝出水毒性的檢測。

(3)纖細裸藻、蠶豆根尖和發光菌的試驗結果表明，進水中顆粒物粒徑越小，毒性越強。經傳統水處理工藝處理后的水源仍可能存在一定的健康隱患。

圖5 不同水樣組對蠶豆根尖細胞的遺傳毒性注：(a). 進、出水；(b). 不同進水處理組；D表示顆粒物直徑；D<1表示粒徑小于1 μm顆粒物組；D≥1表示粒徑大于等于1 μm顆粒物組；*表示與CK(a)/原水(b)相比，P<0.05。Fig. 5 The genotoxicity of different water sample groups on V. faba root tip cellsNote: (a). Inlet and outlet water; (b). Different influent treatment groups; D indicates diameter; D<1 indicates water sample particles diameter is less than 1 μm; D≥1 indicates water sample particles diameter is more than or equal to 1 μm; *indicates P<0.05, compared with control group (a)/raw water group (b).