結腸癌多發肝轉移病灶中Tra-2β、microRNA320α基因與患者生存期的相關性研究

吳天添 朱沛楓 吳康中 汪平 朱煒 金育德 徐永強

[摘要] 目的 研究結腸癌術后化療后患者出現的轉移灶中Tra-2β和microRNA320α基因水平與生存期的關系。 方法 收集2014年6月～2018年12月來我院診治所發現的結腸癌多發肝轉移患者（既往經過結腸癌根治及8次XELOX方案化療的患者），共37例。肝穿刺活檢確定為原結腸癌轉移灶，部分患者選擇性肝介入化療術（方案為奧沙利鉑130 mg/m2+5-FU 500 mg/m2，4次）。化療前穿刺活檢組織通過PCR法比較不同患者Tra-2β、microRNA320α基因的差異，通過多元線性分析Tra-2β、microRNA320α基因分別與轉移瘤最大直徑、轉移總直徑、轉移瘤個數之間的關系，通過Cox分析Tra-2β、microRNA320α基因及患者年齡、最大肝轉移腫瘤直徑、肝轉移總直徑、轉移灶個數、是否行肝介入化療與生存期之間的關系。 結果 Tra-2β基因（13.03±4.05）與轉移灶個數（5.2±1.6）個和總直徑（7.64±2.33）cm呈正相關（P<0.05），microRNA320α基因（0.49±0.17）與轉移灶個數和總直徑呈負相關（P<0.05）。患者自發現肝轉移后中位生存期為14.28個月，1年生存率為67.57%，2年生存率為27.03%，3年生存率為0。發生肝轉移時轉移灶Tra-2β（P=0.009）、肝轉移總直徑（P=0.002）為患者生存預后的獨立相關因素。結論? 結腸癌患者術后化療后多發肝轉移，無法手術切除往往預后較差。Tra-2β基因同肝轉移灶總直徑一樣，是患者生存預后的獨立影響因素，Tra-2β越高，生存期越短。

[關鍵詞] 結腸癌;肝轉移;Tra-2β;microRNA320α;生存分析

[中圖分類號] R735.37? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）05-0001-05

Study on the correlation between Tra-2β and microRNA320α genes in multiple liver metastatic lesions from colon cancer and patients' survival time

WU Tiantian? ?ZHU Peifeng? ?WU Kangzhong? ?WANG Ping? ?ZHU Wei? ?JIN Yude? ? XU Yongqiang

Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Huzhou University， Huzhou? ?313000， China

[Abstract] Objective To study the relationship between Tra-2β and microRNA320α gene levels and survival time in metastatic lesions in patients with colon cancer after postoperative chemotherapy. Methods A total of 37 patients with multiple liver metastases of colon cancer （those who were given radical resection of colon cancer and 8 times of XELOX chemotherapy） who were diagnosed and treated in our hospital from June 2014 to December 2018 were collected. Liver needle biopsy was used to determine the metastatic lesions of primary colon cancer. Selective liver interventional chemotherapy was performed in some patients（the regimen was oxaliplatin 130 mg/m2+5-FU 500 mg/m2， 4 times）. Needle biopsy tissues were performed before chemotherapy， and the differences in Tra-2β and microRNA320α genes in different patients were compared by PCR. The relationships between the Tra-2β and microRNA320α genes and the maximum diameter of the metastatic tumor， the total diameter of the metastasis， and the number of metastatic tumors were analyzed by multiple linear analysis. The relationships between Tra-2β， microRNA320α genes and patient age， maximum liver metastasis tumor diameter， total liver metastasis， number of metastatic lesions， and whether liver interventional chemotherapy was performed and survival time were analyzed by Cox. Results Tra-2β gene （13.03±4.05） was positively correlated with the number of metastatic lesions （5.2±1.6） and total diameter （7.64±2.33 cm） （P<0.05）. The microRNA320α gene （0.49±0.17） was negatively correlated with the number of metastatic lesions and total diameter（P<0.05）. The median survival time of patients after liver metastases was 14.28 months， the 1-year survival rate was 67.57%， the 2-year survival rate was 27.03%， and the 3-year survival rate was 0. Metastatic lesions of Tra-2β（P=0.009） and total diameter of liver metastasis（P=0.002） were independent relevant factors associated with prognosis in patients with liver metastases. Conclusion Patients with colon cancer have multiple liver metastases after chemotherapy. The inoperable resection often results in poor prognosis. Tra-2β gene is the same as the total diameter of liver metastases and is an independent influencing factor for patients' survival and prognosis. The higher the Tra-2β， the shorter the survival period.

[Key words] Colon cancer; Liver metastasis; Tra-2β; microRNA320α; Survival analysis

結直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，已經成為全球第三大常見惡性腫瘤[1]。幾十年來，根治性手術加化療一直是結腸癌的指南化治療方案，進展期結腸癌的化療有XELOX、Mayo、FOLFOX和FOLFIRI方案[2]，K-ras基因是否突變當作為是否在FOLFIRI方案基礎上聯合西妥昔單抗的篩選標準[3]。結腸癌術后化療后一旦出現肝轉移，往往預后較差，絕大部分僅能通過肝動脈介入化療或栓塞療法治療，且效果不佳[4]。

Tra-2β是前體mRNA剪接蛋白基因，不同的器官組織和發育階段，機體對不同的Tra-2蛋白選擇性剪接功能有著不同的需求，其對下游的各種蛋白起到剪接的作用[5]。包括如HER2/neu（c-erbB2）、EGFR等均已被證實為Tra-2剪接蛋白所處理和修飾[6]。因此，Tra-2β在腫瘤的發生和轉移中起到重要的作用，現今國內外僅見Tra-2β基因與結直腸癌的相關性分析，而涉及到肝內轉移癌的未見報道。

本課題所要研究的微小RNA-miRNA-320家族成員共有a、b、c、d、e五種亞型，在腫瘤組織及正常組織中存在顯著差異[7]。Sun等[8]利用RealTime qPCR技術在對3種結腸癌細胞系及40例結腸癌組織進行檢測時發現，miR-320a表達顯著低于GES細胞系及鄰近正常組織，提示miR-320a表達下調可能是結直腸癌的始動因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年6月～2018年12月來我院診治所發現的結腸癌多發肝轉移患者（既往經過結腸癌根治及8次XELOX方案化療的患者），共37例。其中，男25例，女12例;年齡 57～83歲，中位年齡64歲;發現肝轉移后行肝動脈介入化療的患者29例，放棄介入化療的8例。并留取所有患者聯系方式，建立檔案，僅有2人失訪。試驗通過本院倫理委員會采納和批準，試驗前患者及家屬均簽訂知情同意書。

患者的納入：搜尋既往有結腸癌病史并在我院復查發現有肝臟多發占位的患者，進行B超引導下肝臟穿刺活檢，病理證明均為結腸癌來源的轉移灶，共37例。排除標準：①影像學上發現除肝外的其他臟器亦有轉移灶的患者;②影像學評估肝臟殘余容積大于30%～40%的患者（此類患者可行手術切除治療）[9];③既往手術后使用其他化療方案或XELOX化療方案不足8次者（為保證同質性）;④肝穿刺活檢為非結腸來源的或非惡性腫瘤者;⑤無重大基礎疾病者。肝動脈介入化療（TACE）采用右側腹股溝股動脈作為穿刺點，對腫瘤區域肝段或肝葉行局部化療，方案為奧沙利鉑130 mg/m2+5-FU 500 mg/m2。

1.2 基礎試驗方法

1.2.1 RNA的提取? 肝轉移瘤和肝臟正常組織穿刺標本中加入RNA提取液Trizol，研磨勻漿后加入氯仿（每1 mL中加入0.2 mL氯仿）震蕩，完全乳化后4℃12 000 rpm離心5 min，抽取上層澄清液體，移入另一EP管中，加入等體積的異丙醇，-20℃放置2 h以上。4℃ 12 000 rpm離心20 min后，棄去上清液，保留沉淀。加入4℃ 80%乙醇1 mL，4℃ 8000 rpm離心5 min后，棄乙醇，4℃ 7500 rpm離心30 s。保留沉淀。晾干約5 min后，加入20 μL DEPC水溶解。

1.2.2 總RNA濃度、純度、完整性鑒定? 使用Beckman核酸蛋白分析儀進行測量，OD260/280值均在1.9～2.0范圍內。讀取RNA濃度。將RNA提取液5 μL與電泳緩沖液1 μL混合，150 V、40 mA電泳 20 min，觀察結果均顯示28S、18S兩條帶，28S：18S灰度比均為1.5～2.0倍，RNA未降解，-80℃保存。

1.2.3 RNA逆轉錄為DNA? 全部稀釋至400 ng/μL，取2.5 μL RNA加入200 μL EP管中。根據逆轉錄試劑盒說明書，用RNase free水補足到14 μL。PCR儀設定為65℃ 5 min預變性。拿出后每管中加入Primer Mix 1 μL、Enzyme Mix 1 μL、5×Buffer 4 μL，37℃ 1 h、98℃5 min，-20℃冰箱中保存。

1.2.4 目標DNA含量檢測? 取2.5 μL總DNA，加入2×Taq酶 Mix 10 μL、加入目標基因的前后引物（表1）各0.6 μL，補DD水11.3 μL，共25 μL。每個樣本設2個復孔。加樣后，放入ABI7500 PCR儀中95℃反應5 min。95℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 6 min，此3步反應循環共35次后，12℃ PCR儀內保存。儀器內讀CT值，目標基因與內參CT值相減，每個樣本2個復孔取平均ΔCT值，再將腫瘤組織ΔCT值與正常組織ΔCT值相減，得到ΔΔCT值，最終表述為2-ΔΔCT進行比較。

1.3 統計學方法

使用SPSS 23.0軟件進行統計，Tra-2β、microRNA320α以2-ΔΔCT進行表示。結果2.1、2.2采用多元線性回歸分析，Tra-2β、microRNA320α與CEA、CA125、CA199、轉移瘤最大直徑、轉移總直徑、轉移瘤個數均為計量資料，以（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義;結果2.3采用比例風險（Cox）回歸分析（亦稱生存分析），明確上述基因是否與患者自發現肝轉移后的生存期有關，結果除是否行TACE治療（計數資料）外，其他均為計量資料，以（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tra-2β與結腸癌肝轉移各項指標的相關性比較

轉移瘤數、最大轉移瘤直徑、轉移瘤總直徑與Tra-2β的相關性比較結果：Tra-2β基因與轉移瘤個數和總直徑呈正相關，而與最大轉移瘤直徑無關。見表2。

2.2 microRNA320α與結腸癌肝轉移各項指標的相關性比較

轉移瘤數、最大轉移瘤直徑、轉移瘤總直徑與microRNA320α的相關性比較結果：microRNA320α基因與轉移瘤個數和總直徑呈負相關，而與最大轉移瘤直徑無關。見表3。

2.3 37例晚期結腸癌患者的生存分析

患者自發現肝轉移后中位生存期為14.28個月（1.19年），1年生存率為67.57%，2年生存率為27.03%，3年生存率為0（有2例失訪）。生存分析提示僅Tra-2β、轉移瘤總直徑與患者預后（生存時間）相關，是患者生存預后的獨立影響因素，Tra-2β越高，生存期越短，而miRNA320α則與患者的生存期無關。見表4及圖1。

3 討論

肝臟是結腸癌晚期最易轉移的臟器，目前認為黏液腺癌是導致轉移和死亡的重要因素，出現肝臟轉移后預后往往極差[10]。腹壁造瘺、疼痛、腸梗阻等嚴重影響著結腸癌晚期患者的生活質量，有臨床試驗表明，無癥狀的結腸癌晚期患者肝轉移，僅使用化療和靶向藥物并未縮短患者生存期[11]。研究結腸癌肝轉移預后的相關因素，能為此類患者今后的治療提供一定的理論依據。

隨著基因研究逐漸深入，Tra-2β作為前體mRNA剪輯蛋白基因，通過結合到富含嘌呤的增強子RNA序列上發揮作用，在正常和病理狀態下均有相當的表達[12]。人體Tra-2β在大腦內剪接活動水平最高[13]，其次為肝、睪丸等，可作用于下游眾多結構和功能蛋白的基因修飾，如MDM2、Bin1、FGFR-2等，已經在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌以及大腸癌中被廣泛研究[14]。基礎研究發現Tra-2β缺乏會導致小鼠胚胎發育異常[15]，尤其對神經組織及生殖細胞影響較大，但眾多的腫瘤相關性研究發現Tra-2β的上調會導致腫瘤侵襲性升高[16-17]。

而microRNA-320α的表達則在腫瘤及正常組織中存在顯著差異。Zhang等[18]通過對62例結腸癌患者的臨床病理特征分析顯示低水平的miR-320α與肝、腹膜轉移率高、臨床分期晚顯著相關，提示miR-320α在腫瘤進展期具有抑制細胞侵襲、轉移的作用。另外，作為10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因腫瘤抑制軸的關鍵成員，microRNA320在改變腫瘤微環境和減少腫瘤進展中也發揮了重要作用[19]。在吉西他濱化療的膽管癌細胞、順鉑或5-Fu化療的食管癌細胞，以及耐吉西他濱的胰腺癌細胞系的研究中均發現miRNA-320表達上調[20]，此外，胃腸道間質瘤miR-320α表達降低與伊馬替尼抵抗相關[21-22]，提示miRNA320α可能參與腫瘤化療耐藥形成，并不是單純僅與腫瘤的分級或分期呈負相關。最新的研究報道，也證實了miRNA320的降低對大多數惡性腫瘤均具有廣譜的化療耐藥性[23]。

本研究探討了Tra-2β、microRNA320α與結腸癌晚期肝轉移患者轉移灶中的轉錄情況，以及臨床指標間的相關性。結果提示Tra-2β和microRNA320α均與肝內轉移灶數量及轉移灶總直徑相關（P<0.05）;Tra-2β、肝內腫瘤轉移總直徑與患者的生存時間有明顯的相關性（P<0.05）;本研究中，miRNA-320α與患者的生存期并無相關性，但有通過本實驗研究趨勢，對結腸癌晚期肝轉移患者的治療方案有一定指導意義，單純肝臟介入化療對此類患者的生存期并沒有明顯的延長作用，但仍需要加大樣本量以驗證這一結論的適用性。結腸癌晚期患者個體化治療十分重要，對于結腸癌晚期肝轉移的患者再次行肝臟手術是否必要，一直存在很大爭論[24]。但國內有文獻報道，對于結腸癌晚期多發性肝轉移患者行姑息性肝臟腫瘤切除，是生存預后的一項保護性因素，數據顯示可延長此類患者生存期10個月左右[25]。肝臟介入化療、再次全身化療、靶向治療、肝動脈選擇性栓塞、門靜脈側支選擇性栓塞療法等均可在短期內改善減少或縮小肝內轉移灶，可能對總生存期也有獲益，但遠期的生存質量是否有明顯的改善現仍存在爭議[26]。目前，臨床仍缺乏很好的預后評價系統來制定個體化的治療方案，在肝多發轉移后行手術或保守治療沒有統一標準，本試驗證明了Tra-2β是結腸癌肝轉移生存期縮短的獨立危險因素，雖不是結腸癌的特異性指標，但可作為結腸癌預后的評價指標。本院近年來發現結腸癌肝轉移患者的數量較少，總樣本量偏少，結果可能存在偏倚，仍需在今后擴大樣本量來進一步研究，以明確Tra-2β在結腸癌進展中的作用。

[參考文獻]

[1] Siegel R，Ma J，Zou Z，et al. Cancer statistics，2014[J]. Ca A Cancer Journal for Clinicians，2014，64（1）：9-29.

[2] Benson AB，Venook AP，Cederquist L，et al. NCCN clinical practice guidelines in oncology[J]. Colon Cancer，2017， 15（3）：370-398.

[3] Van Cutsem E，Cervantes A，Nordlinger B，et al. Metastatic colorectal cancer： ESMO clinical practice guidelines for diagnosis，treatment and follow-up[J]. Annals of Oncology，2014，25（suppl_3）：iii1-iii9.

[4] Menahem B，Duvoux C，Ganne N，et al. Liver Resection for Solitary Transplantable Hepatocellular Carcinoma：The role of AFP-Score[J]. World? Journal of? Surgery，2019， 43（1）：221-229.

[5] Tajnik M，Rogalska ME，Bussani E，et al. Molecular basis and therapeutic strategies to rescue factor IX variants that affect splicing and protein function[J]. PLoS Genetics，2016，12（5）：e1006082（1-16）.

[6] Subik K，Lee JF，Baxter L，et al. The expression patterns of ER，PR，HER2，CK5/6，EGFR，Ki-67 and AR by immunohistochemical analysis in breast cancer cell lines[J]. Breast Cancer：Basic and Clinical Research，2010，4（20）：35-41.

[7] Li MH，Fu SB，Xiao HS，et al. Genome-wide analysis of microRNA and mRNA expression signatures in cancer[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2015， 36（10）：1-12.

[8] Nan，Jing，Lili，et al. Expression levels of miR-205 and miR-506 in colon cancer tissues and their relationships with clinicopathological features[J]. Oncology letters，2018， 16（4）：4331-4336.

[9] 中華醫學會外科學分會胃腸外科學組，中華醫學會外科學分會結直腸外科學組，中國抗癌協會大腸癌專業委員會，等. 中國結直腸癌肝轉移診斷和綜合治療指南（2018版）[J]. 中華消化外科雜志，2018，38（7）：707-718.

[10] Adam R，De Gramont A，Figueras J，et al. Managing synchronous liver metastases from colorectal cancer：A multidisciplinary international consensus[J]. Cancer? Treatment Reviews，2015，41（9）：729-741.

[11] Poultsides GA，Servais EL，Saltz LB，et al. Outcome of primary tumor in patients with synchronous stage IV colorectal cancer receiving combination chemotherapy without surgery as initial treatment[J]. Journal of Clinical Oncology，2009，27（20）：3379-3384.

[12] Latorre E，Harries LW. Splicing regulatory factors，ageing and age-related disease[J]，Ageing Research Reviews，2017， 36（4）：165-170.

[13] Storbeck M，Hupperich K，Gaspar JA，et al. Neuronal-specific deficiency of the splicing factor Tra2b causes apoptosis in neurogenic areas of the developing mouse brain[J]. PLoS One，2014，9（2）：e89020（1-16）.

[14] Xu Y，Hu J，Zhang C，et al. MicroRNA 320 targets mitogen-activated protein kinase 1 to inhibit cell proliferation and invasion in epithelial ovarian cancer[J]. Molecular? Medicine Reports，2017，16（6）：8530-8536.

[15] Roberts JM，Ennajdaoui H，Edmondson C，et al. Splicing factor TRA2B is required for neural progenitor survival[J].Journal of Comparative Neurology，2014，522（2）：372-392.

[16] Swallow DM，Povey S，Parkar M，et al. Mapping of the gene coding for the human liver/bone/kidney isozyme of alkaline phosphatase to chromosome 1[J]. Annals of Human Genetics，1986，50（3）：229-235.

[17] Best A，Dagliesh C，Ehrmann I，et al. Expression of tra2β in cancer cells as a potential contributory factor to neoplasia and metastasis[J].International Journal of Cell Biology，2013，2013（9）：1-9.

[18] Zhang L，Huang J，Yang N，et al. microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in human cancer[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2006， 103（24）：9136-9141.

[19] Rupaimoole R，Calin GA，Lopez-Berestein G，et al. miRNA deregulation in cancer cells and the tumor microenvironment[J]. Cancer Discovery，2016，6（3）：235-246.

[20] Iwagami Y，Eguchi H，Nagano H，et al. miR-320c regulates gemcitabine-resistance in pancreatic cancer via SMARCC1[J]. British Journal of Cancer，2013，109（2）：502-511.

[21] Tong HX，Zhou YH，Hou YY，et al. Expression profile of microRNAs in gastrointestinal stromal tumors revealed by high throughput quantitative RT-PCR microarray[J]. World Journal of Gastroenterology：WJG，2015，21（19）：5843-5855.

[22] Shi Y，Gao X，Hu Q，et al. PIK3C2A is a gene-specific target of microRNA-518a-5p in imatinib mesylate-resistant gastrointestinal stromal tumor[J]. Laboratory Investigation，2016，96（6）：652-661.

[23] Si W，Shen J，Zheng H，et al. The role and mechanisms of action of microRNAs in cancer drug resistance[J]. Clinical Epigenetics，2019，11（1）：25-49.

[24] Tan W，Chew M，Tan I，et al. Palliative surgical intervention in metastatic colorectal carcinoma：A prospective analysis of quality of life[J]. Colorectal Disease，2016，18（4）：357-363.

[25] 朱峰鋒，司馬輝，宋金超，等. 無法治愈的晚期結直腸癌肝轉移患者的臨床病理特征與姑息性治療預后的生存分析[J].現代腫瘤醫學，2016，24（5）：756-761.

[26] Moutinho V，Connell LC，D'angelica MI，et al. Hepatic artery therapies for unresectable colorectal liver metastases：Pooled survival analysis of 968 patients from TACE，yttrium-90，and HAI studies[J]. Journal of Clinical Oncology，2017，35（4）：747-753.

（收稿日期：2019-04-24）