Th22、Treg細胞轉錄因子及細胞因子在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達及意義

王連云　張瓊　金栩冰　熊文棟　葉文　王繁

[摘要] 目的 通過檢測子癇前期孕婦胎盤組織中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細胞轉錄因子AHR、Foxp3及細胞因子IL-22、IL-10的表達，探討其在子癇前期中的作用。 方法 選取35例明確診斷的子癇前期孕婦為研究組，同時選取正常妊娠孕婦35例為對照組，采用實時熒光定量PCR檢測兩組孕婦胎盤組織中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細胞轉錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表達情況;采用免疫組化檢測細胞因子IL-22、IL-10的表達。 結果 AHR mRNA在研究組和對照組的表達量分別為（1.85±0.47）和（0.89±0.26），Foxp3 mRNA在兩組的表達量分別為（0.76±0.23）和（1.31±0.42），差異均具有統計學意義;IL-22在研究組和對照組的陽性表達率分別為68.57%和40.00%，IL-10在兩組的表達率為34.29%和60.00%，差異也具有統計學意義。 結論 Th22、Treg細胞轉錄因子及細胞因子的異常表達，可能參與了子癇前期的發生。

[關鍵詞] 子癇前期;Th22細胞;調節T細胞;轉錄因子;細胞因子

[中圖分類號] R714.244? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）05-0038-04

Expression and significance of Th22， Treg cell transcription factors and cytokines in placenta tissue of preeclampsia pregnant women

WANG Lianyun? ZHANG Qiong? JIN Xubing? XIONG Wendong? YE Wen? WANG Fan

Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? 325027， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Th22， CD4+CD25+CD127low Treg cell transcription factors AHR， Foxp3， and cytokines IL-22 and IL-10 in the placenta of preeclampsia pregnant women， and to explore their role in preeclampsia. Methods Thirty-five definite pregnant women with preeclampsia were selected as the study group， while 35 normal pregnant women were selected as the control group. The Th22， CD4+CD25+CD127low Treg cell transcription factor AHR mRNA and Foxp3 mRNA expressions in placental tissues of two groups of pregnant women were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The cytokine IL-22 and IL-10 expressions were detected by immunohistochemical method. Results The expression levels of AHR mRNA in the study group and control group were（1.85±0.47） and （0.89±0.26）， respectively. The expression levels of Foxp3 mRNA in the two groups were （0.76±0.23） and （1.31±0.42）， and the differences were statistically significant. The positive expression rates of IL-22 in the study group and control group were 68.57% and 40.00%， respectively. The expression rates of IL-10 in the two groups were 34.29% and 60.00%， and the differences were also statistically significant. Conclusion The abnormal expression of Th22 and Treg cell transcription factors and cytokines may be involved in the occurrence of preeclampsia.

[Key words] Preeclampsia; Th22 cells; Regulatory T cells; Transcription factors; Cytokines

子癇前期（Preeclampsia，PE）是妊娠與血壓升高并存的一種疾病，發生率約為5%左右，可致孕產婦多器官功能損害，嚴重者可導致子癇甚至孕產婦和圍生兒的死亡，是造成孕產婦和圍生兒死亡的主要原因之一[1，2]。近年來，隨著我國二胎政策的開放，高危妊娠產婦明顯增多，子癇前期的發病率也呈逐漸升高趨勢[3]。到目前為止，PE的病因及發病機制尚未完全闡明。近年來的研究初步表明免疫功能紊亂是PE發生的一個重要原因，PE孕婦往往存在炎癥免疫過度的激活[4]。目前免疫因素的研究主要集中在Toll樣受體家族、蛻膜自然殺傷細胞、巨噬細胞等方面，而子癇前期特異性免疫研究集中在T淋巴細胞，研究表明在PE孕婦中存在著T淋巴細胞的免疫異常[5]。本研究通過檢測PE孕婦胎盤組織中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細胞轉錄因子AHR（芳香烴受體）、Foxp3（叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子）mRNA及相關細胞因子IL-22、IL-10的表達情況，以探討其在PE發生、發展過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2018年11月～2019年5月在我院定期產檢、診斷、住院治療直至分娩的PE孕婦35例為研究組;搜集同期在我院定期產檢并住院分娩的正常妊娠孕婦，其孕周、年齡與研究組相近、產檢無異常且隨訪至產后42 d亦無異常的健康孕婦35例為對照組。所有入選孕婦孕前均無內外科疾病，均為單胎妊娠，且無其他妊娠合并癥及并發癥。PE的診斷嚴格按照謝幸、孔北華、段濤主編《婦產科學》第9版的診斷標準進行診斷[6]。所有研究對象均簽署知情同意書，且經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 取材方法? 所有入組孕婦在胎盤娩出后立即采集胎盤組織：于胎盤中央母體面取大小約1 cm×1 cm×1 cm組織，避開出血、壞死、鈣化區，使用生理鹽水沖洗后，置入經DEPC處理的EP管中，轉移至-80℃冰箱待統一檢測。同法再取約1 cm×1 cm×1 cm 大小的胎盤組織，應用生理鹽水充分漂洗，10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續4 μm切片，保存，待統一檢測。

1.2.2 主要儀器和試劑? ABI7500 PCR系統及SYBRgreen I購自美國ABI公司;紫外分光光度計購自德國默克生物科技公司。總RNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;免疫組化儀器購自美國羅氏公司;免疫組化實驗試劑盒購自福建邁新生物技術開發有限公司。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測Th22、CD4+CD25+CD127low Treg細胞轉錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表達? 采用Trizol試劑一步法提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計，測定其在260 nm和280 nm的吸光度，計算RNA純度，使RNA的純度符合要求。利用瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，再將所得到的RNA按照反轉錄試劑盒說明逆轉錄成cDNA。對cDNA進行PCR擴增，PCR反應體系：上、下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶10 μL，模板10 μL，雙蒸水7.2 μL。PCR反應條件：95℃ 30 s，1個循環;95℃ 10 min，95℃ 15 s，;61℃ 1 min，共45個循環。采用ABI7500 PCR系統及SYBRgreen I染料法進行熒光定量PCR檢測，采用β-actin 作為內參照。GenBank上查找目的基因mRNA序列，引物由Primer 5.0軟件設計（表1），由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.4 免疫組化檢測兩組孕婦胎盤組織中細胞因子IL-22、IL-10 的表達? 所有標本采用免疫組化檢測IL-22和IL-10的表達，實驗步驟嚴格按照儀器及試劑盒說明進行操作。IL-22和IL-10在胎盤組織中的陽性表達表現為細胞漿或細胞核內出現棕黃色顆粒。采用半定量評分法，400倍鏡下任意觀察5個視野。根據陽性細胞所占百分數及顏色的強度，分為①陰性（-）：0分;②弱陽性（+）：l～4分;③中等陽性（++）：5～8分;④強陽性（+++）：9～12分[7]。

1.3 觀察指標

記錄兩組孕婦年齡、分娩孕周、收縮壓、舒張壓、尿蛋白及新生兒出生體重等情況;記錄轉錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA在兩組孕婦胎盤中的表達情況，其中基因表達采用2-ΔCT法比較，ΔCT=CT目的基因-CT內參基因;并記錄兩組孕婦細胞因子IL-22、IL-10在胎盤組織中的陽性表達情況。

1.4 統計學處理

運用SPSS 19.0統計軟件對所得數據進行處理，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;計數資料采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦臨床資料比較

研究組孕婦和對照組孕婦年齡、分娩孕周比較差異無統計學意義（P>0.05）;研究組孕婦收縮壓、舒張壓及尿蛋白較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;而研究組新生兒出生體重明顯低于對照組，其差異亦具有統計學意義（P<0.05）（表2）。

2.2 兩組孕婦胎盤組織中Th22、Treg細胞轉錄因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表達水平比較

研究組孕婦胎盤組織中Th22細胞轉錄因子AHR mRNA的表達量為（1.85±0.47），對照組孕婦胎盤組織中的Th22細胞轉錄因子AHR mRNA的表達量為（0.89±0.26），兩組相比差異有統計學意義（P<0.01）;而Treg細胞轉錄因子Foxp3 mRNA的表達量在研究組中明顯低于對照組，差異也具有統計學意義（P<0.01）（表3）。

2.3 兩組孕婦胎盤組織中細胞因子IL-22、IL-10的表達水平比較

本研究結果顯示，IL-22在研究組孕婦胎盤組織中的陽性表達率為68.57%，明顯高于其在對照組中的陽性表達率，差異有統計學意義（P<0.05）;IL-10在研究組孕婦胎盤組織中的陽性表達率低于對照組，差異亦具有統計學意義（P<0.05）（表4）。

3 討論

妊娠被認為是一種成功的半同體移植，一次成功的妊娠需要母胎間免疫平衡的維持，這種免疫平衡的破壞是妊娠期高血壓疾病發生的一個重要原因。臨床觀察發現，胎盤娩出后子癇前期的病情往往得到較快的緩解，因此，胎盤被認為是子癇前期發生的始發病灶。近年來的研究發現，T細胞在子癇前期孕婦中存在異常分化，致使子癇前期孕婦出現異常的T細胞免疫及其功能因子的異常分泌[8]，這可能是導致子癇前期發生的重要原因。

AHR屬于異二聚體轉錄調控子的堿性螺旋-環-螺旋超家族中新發現的PAS亞家族中的一種，是一種配體激活轉錄因子，其表達于哺乳動物的肝臟、皮膚、肺、消化道、黏膜上皮細胞和胎盤等組織上[9-10]。在T細胞的分化過程中，通過AHR的作用，能使初始T細胞向Th22細胞分化，但這個過程受到其他細胞因子的影響：如IL-6、TNF-α可以促進Th22細胞的分化，而IL-10、轉化生長因子-β等則會抑制Th22細胞的分化[11-12]。Th22細胞是最新發現的一群在功能和分化上獨立的CD4+T淋巴細胞亞群，其能分泌特征性的功能因子IL-22。IL-22由活化后的T 細胞產生，Th17細胞、Th22 等均可能產生IL-22，但在所有分泌IL-22的T細胞亞群中，Th22細胞所占比例為37%～63%。Th22細胞分泌的IL-22與自身功能的發揮密切相關，Th22細胞主要是通過IL-22發揮功能[13-14]。目前的研究表明，Th22 細胞、IL-22在自身免疫性疾病、感染性疾病、炎癥性腸病及惡性腫瘤中均發揮著重要的作用[15-17]。通過本研究發現，子癇前期孕婦胎盤組織中AHR mRNA異常高表達，IL-22亦異常高表達，提示Th22細胞在子癇前期孕婦中存在異常表達，這種免疫紊亂可能是子癇前期的發生原因，但是具體作用方式及作用機制尚需進一步研究發現。

Treg細胞是一類高表達CD4、CD25，低表達CD127，分泌IL-10和轉化生長因子-β的細胞亞群，在抑制自身免疫性疾病、介導異體器官移植免疫耐受中發揮重要作用[18]，其能夠在母胎界面直接調節免疫反應，叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子（forkhead box protein-3，Foxp3）是Treg細胞的特異性標志，在Treg細胞發育和功能維持中起著重要作用[19]。Treg細胞分泌多種細胞因子，IL-10是其中一種。近年來研究顯示子癇前期孕婦外周血中Treg細胞數量與正常妊娠者相比明顯減少[20]，因此推測Foxp3 的表達下降可能與Treg細胞數量減少有關。本研究顯示，Foxp3 mRNA在子癇前期孕婦胎盤中的表達較正常妊娠孕婦明顯下降，這與范月蓮等[21]研究結果一致，且我們的研究亦提示Treg細胞的細胞因子IL-10在胎盤中的表達亦明顯下降，提示在子癇前期孕婦中存在Treg細胞的轉錄因子及細胞因子的表達失衡，考慮其參與子癇前期的發生。

綜上所述，Th22細胞轉錄因子及細胞因子在子癇前期孕婦胎盤中高表達，而Treg細胞轉錄因子及細胞因子在子癇前期孕婦中低表達，提示Th22、Treg細胞在子癇前期孕婦中存在表達失衡與紊亂，這種免疫紊亂可能是子癇前期的發生原因，深入研究其變化規律及作用機制，對明確子癇前期的發生原因有重要意義。

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（收稿日期：2019-10-24）