蘆筍兩性花與雄花的碳氮比及氮化合物相關基因可變剪接的差異分析

黃 玲,韋樹谷,賴 佳,代順冬,張騫方,曾華蘭,劉 佳,劉 杭,葉鵬盛

(四川省農業科學院 經濟作物育種栽培研究所, 蔬菜種質與品種創新四川省重點實驗室,四川 成都 610300)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)屬于天門冬科天門冬屬多年生植物,由于其具有較高的營養價值和較好的藥用保健功能而深受人們喜愛[1]。蘆筍雌雄異株,其性染色體處于植物性染色體進化途徑的中間位置,性別表現出多種類型,包括雌株(XX)、雄株(XY)、超雄株(YY)和雄性雌型株(簡稱兩性株,基因型為XY)。它們之間主要的差異表現在花器官上。雌花具有健全的雌蕊,但雄蕊高度退化；而雄花具有發育良好的雄蕊,但雌蕊發育不完全,有的形成花柱,無柱頭,有的既無花柱也無柱頭。兩性花含有完整的雄蕊,雌蕊發育完全,含有子房、花柱和柱頭,并能正常結實[2-4]。因此,兩性花是研究植物花器官發育、性別決定與分化的特殊遺傳材料[5]。此外,由于兩性花自花或異花授粉(XY×XY→1YY +2XY +1XX),產生超雄株(YY)。以它作為父本產生的后代全部為雄株(XX×YY→XY )。已有研究表明,蘆筍雄株產量較同期雌株高[6],因此培育全雄品種是蘆筍育種的重要方向,而兩性株是培育蘆筍全雄品種的重要資源材料。但自然界中存在的兩性株極少,這極大地限制了蘆筍種質資源創新和全雄品種選育。因此,研究蘆筍性別調控機理,將為促進兩性花形成和豐富蘆筍資源材料奠定基礎。

已有研究表明,碳氮比與植物花芽性別分化相關[7-8]。碳氮化合物是植物花芽分化過程中重要的營養物質。20世紀初提出的碳氮比學說認為碳氮比對控制花芽分化起著重要作用[9]。在希爾核桃中,發現N的缺乏會加劇雌花敗育,并且雌花敗育時,2年生核桃枝條木質部中的氮和淀粉含量降低到最低點[10]。張建銘等[11]研究大花梔子花芽分化過程中碳氮比的變化,發現在花芽孕育期碳氮比急劇升高,推測碳氮比對于花芽孕育起著主要的作用。為探明蘆筍兩性花、雄花發育與碳氮化合物的關系,本研究比較分析了蘆筍兩性花與雄花不同發育階段碳氮化合物含量及相關基因表達水平的動態變化,將有助于揭示蘆筍兩性花與雄花發育的調控機理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以蘆筍品種冠軍為試驗材料,并將其種植于四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所試驗基地。在2016-2018年春季蘆筍現蕾期-開花期進行形態學觀察。在蘆筍盛花期分別挑取20株正常生長且生長較一致的兩性株和雄株,按照花蕾從小到大分為(0.7±0.1)mm，(1.5±0.1)mm，(2.0±0.1)mm，(3.5±0.1)mm共4個級別,在Leica S8APO體式顯微鏡下對其形態特征進行觀察比較,每級觀察30個花蕾。花蕾從植株上摘下后,立即觀察,將花蕾一半的花瓣剝離,置于體式顯微鏡下觀察拍照,對比同一時期的兩性花、雄花花蕾的形態差異,具兩性花特點并且后期結出果實的雄性雌型株標記為兩性株。

1.2 碳氮化合物的測定

分別取兩性株、雄株發育至性別分化與性別決定的前期(花蕾長度(0.7±0.1)mm)、中期(花蕾長度(1.5±0.1)mm)、后期(花蕾長度(2.0±0.1)mm)3個時期的花蕾2 g。樣品烘干后研磨粉碎至0.15 mm,采用島津NC-80型全自動碳氮分析儀測定兩性花蕾與雄花蕾的碳、氮化合物總含量。

1.3 RNA 提取、文庫構建和測序

分別提取兩性花、雄花3個時期的花蕾總RNA。采用TRIzol(購于Invitrogen 公司)進行總RNA的提取。依據兩性花、雄花發育時期的先后順序,將各時期RNA 池分別標記為H1、H2、H3、M1、M2、M3。RNA-Seq測序由深圳華大基因研究院完成,采用 Hi Seq X10 測序。

1.4 數據分析方法

1.4.1 可變剪接事件鑒定 從蘆筍基因組數據庫下載蘆筍全基因組序列及其注釋文件(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/?term=Asparagus+officinalis+L.)。采用軟件HISAT2將RNA-seq測序得到的高質量數據序列與蘆筍基因組進行序列比對,使用rMATs軟件對樣品中可變剪接事件進行分類和統計。主要的可變剪接事件有5種:外顯子跳躍、內含子滯留、5′端可變剪切位點、3′端可變剪切位點、互斥外顯子。

1.4.2 發生可變剪接基因的功能注釋及富集分析 對于雄花與兩性花各發育時期中發生可變剪接的基因,本研究采用rMATS軟件分析了各樣本中共有及特有的可變剪接基因數量。應用TermFinder軟件,獲得包括生物學過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和細胞構成(Cellular component)等類別的GO 注釋編號。利用在線工具(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)進行功能富集分析,統計每個GO類別中基因與背景基因間的差異,并對P值進行校正。定義校正后的P≤0.05為該基因集在此GO項中顯著富集。

2 結果與分析

2.1 蘆筍兩性花、雄花形態差異的分析

利用體式顯微鏡觀察蘆筍兩性花、雄花的4個不同發育時期(花蕾長度分別為(0.7±0.1)mm，(1.5±0.1)mm，(2.0±0.1)mm，(3.5±0.1)mm)的形態特征(圖1),顯示了由兩性花向單性花發育的動態變化過程。蘆筍兩性花、雄性花蕾在發育前期(0.7±0.1)mm的花器官中均既有雄蕊又有心皮。當花蕾發育至1.5 mm時,兩性花中雌蕊花柱開始發育,出現了明顯的花柱和柱頭,而雄花中未見花柱及柱頭。當花蕾發育至2.0 mm時,兩性花的雄蕊繼續發育,花絲伸長,子房繼續膨大,分化出花柱并伸長,形成明顯的柱頭；而雄花中雄蕊繼續發育,花絲伸長,花柱和柱頭發育受阻,不形成花柱和柱頭。當花蕾發育至3.5 mm時,兩性花已發育完全,有發育良好的雄蕊、子房、花柱和柱頭；而雄花中雄蕊發育良好,子房發育停滯,不形成花柱和柱頭。Caporali等[12]利用電子顯微鏡觀察比較了蘆筍不同發育時期的雌、雄花形態,發現蘆筍花蕾由兩性花向單性花轉變時的形態特點是花柱開始發育。本研究發現花蕾長度約1.5 mm時為兩性花的花柱開始發育,表明花蕾長度為1.5 mm時,是兩性花向單性花轉變的關鍵時期。

2.2 蘆筍兩性花、雄花碳氮化合物含量的差異分析

通過測定蘆筍兩性花與雄花在性別分化的前期、中期、后期3個時期花蕾中碳氮化合物含量(表1),發現在性別分化的前期、中期,兩性花蕾中碳含量均低于雄花蕾,但差異不顯著,氮含量顯著高于雄花蕾,特別是在性別分化中期的差異較大；在性別分化后期,兩性花蕾中碳含量與雄花蕾相當,但氮含量仍然顯著高于雄花蕾。在蘆筍兩性花發育的整個過程中C/N比值始終低于雄花,并且在性別分化的中期、后期差異達到顯著水平。可見,兩性花中雌蕊的發育需要較高的氮素,即較低的C/N比值有利于雌蕊的發育。兩性花中碳含量隨著花發育先降低后升高,雄花中碳含量的變化趨勢與兩性花中一致。兩性花中氮含量隨著花發育逐漸降低,雄花中氮含量先降低后略有升高。

表1 蘆筍兩性花與雄花不同發育時期碳氮化合物含量的變化Tab.1 The dynamics of the carbon and nitrogen compound content in hermaphroditic flowers and male flowers of asparagus at different developmental stages

注:時期Ⅰ為花蕾發育至0.7 mm;時期Ⅱ為花蕾發育至1.5 mm;時期Ⅲ為花蕾發育至2.0 mm。H.兩性花;M.雄花。表中數據為平均值±標準差,采用T檢驗法檢驗了數據顯著性(P<0.05),同一發育時期相同指標不同小寫字母表示兩性花與雄花差異顯著。

Note:Stage I represents the flower bud development to 0.7 mm; Stage Ⅱrepresents the flower bud development to 1.5 mm; Stage Ⅲ represents the flower bud development to 2.0 mm. H. The hermaphroditic flower; M. The male flower. The data in the table are average±standard deviation, the significance of the data is tested byT-test(P<0.05). Different lowercase letter represents significant difference between the hermaphroditic flower and male flower in the some index at the same stage.

2.3 蘆筍兩性花、雄花氮化合物相關基因可變剪接事件的差異分析

為了解蘆筍兩性花、雄花中發生可變剪接基因的功能,對所有發生可變剪接的基因進行了GO分析。結果表明,蘆筍兩性花與雄花相比,其特有可變剪接基因顯著富集到細胞氮化合物代謝過程、有機氮化合物代謝過程和細胞氮化合物生物合成過程等5條氮化合物代謝相關的GO條目中,共包含相關基因86個(表2),而雄花特有可變剪接基因在此GO條目中沒有富集,反映了氮化合物代謝相關的GO條目與蘆筍兩性花發育的關系十分緊密。

表2 蘆筍兩性花特有可變剪接基因中氮化合物代謝相關基因的GO分類信息Tab.2 GO classification information of nitrogen compound related genes only in alternative splicing genes specific to asparagus hermaphroditic flower

找到蘆筍兩性花特有的可變剪接基因中86個氮化合物代謝相關基因在蘆筍參考基因組上的注釋信息(表3),發現它們主要為編碼核糖體蛋白基因、MADS-box轉錄因子和一些酶類物質等,其中以編碼核糖體蛋白基因數量最多。表明,蘆筍兩性花的形成與核糖體蛋白基因、MADS-box轉錄因子和一些酶類物質等氮化合物代謝相關。

表3 蘆筍兩性花特有可變剪接基因中氮化合物代謝相關基因的注釋信息Tab.3 The annotation information of nitrogen compound related genes in alternative splicing genes specific to asparagus hermaphroditic flowers

表3(續)

蘆筍兩性花特有可變剪接基因中86個氮化合物代謝相關基因在3個發育時期均發生了可變剪接事件,并且3個發育時期內共發生了374個可變剪接事件(表4)。進一步反映了可變剪接與氮化合物合成相關基因表達的關系非常密切。這些基因發生可變剪接的類型主要有5種,其中以A3SS類型最多,A5SS次之,MXE最少。并且在不同的發育時期,大多數基因發生可變剪接事件的類型和次數存在差異。86個基因發生可變剪接事件的時間主要在兩性花性別分化前期,該時期中發生了2次及以上可變剪接的基因有37個,而在兩性花性別分化的中期和后期分別有29,30個。這些剪接事件在雄花中并未檢測到,說明氮化合物代謝相關基因可能與兩性花的形成相關?；虬l生可變剪接以后可能引起其編碼蛋白的含量及功能改變,這一結論正好與前面試驗中檢測到蘆筍兩性花與雄花蕾中氮化合物含量存在差異相吻合。

2.4 蘆筍兩性花發生特有可變剪接的氮化合物相關基因表達分析

依據FPKM值,進一步分析了上述氮化合物代謝相關基因在蘆筍兩性花與雄花中的表達情況(圖2)。結果表明,在蘆筍兩性花與雄花的不同發育時期這86個氮化合物代謝相關基因的表達量均存在差異。與雄花蕾相比,在兩性花性別分化的前期、中期,分別有52,47個氮化合物代謝相關基因高表達；而在兩性花性別分化后期,略高于雄花蕾的氮化合物代謝相關基因只有38個。這與兩性花蕾中含氮量高于雄花蕾的差異一致。說明在性別分化的前期、中期,兩性花蕾中氮化合物代謝相關基因的高表達,可能引起了氮化合物含量的增加。這進一步表明蘆筍兩性花與雄花中氮化合物代謝相關基因的差異表達可能是引起它們性別分化差異的重要因素。

表4 蘆筍兩性花特有可變剪接基因中氮化合物代謝相關基因的可變剪接類型Tab.4 The alternative splicing types of nitrogen compound related genes in alternative splicing genes specific to asparagus hermaphroditic flowers

注:A3SS.3′端可變剪切位點； ES.外顯子跳躍； IR.內含子滯留；A5SS.5′端可變剪切位點； MXE.外顯子互斥。

Note:A3SS.Alternative 3′ splice site；ES.Exon skipping；IR.Intron retention；A5SS.Alternative 5′ splice site；MXE.Mutually exclusive exon.

圖2 蘆筍兩性花、雄花蕾中氮化合物相關基因的表達量差異Fig.2 Expression differences of nitrogen compound related genes in the hermaphroditic and male flower buds

此外,在蘆筍兩性花發育進程中,86個氮化合物代謝相關基因中有67個基因表達量在性別分化中期低于性別分化前期,有44個基因表達量在性別分化后期低于性別分化中期,這與兩性花中氮化合物含量逐漸降低的變化趨勢一致。在蘆筍雄花由性別分化前期到中期的過程中,有56個基因表達量降低；在性別分化中期到后期的過程中,有34個基因表達量降低,31個基因表達量略有升高,這與雄花中氮化合物含量先降低后略升高的變化趨勢一致。

3 討論

在眾多的植物花芽分化研究理論中,碳氮比理論認為碳氮比對植物花性別的分化有較大的影響[8,11]。肖華山等[7]發現荔枝花中較小的C/N比值和較高的氨基酸含量有利于雌蕊分化。李利紅等[13]發現杏花雌蕊發育較好則其氨基酸含量也較高。本研究測定了兩性花與雄花在性別分化的前期、中期、后期3個時期花蕾中碳氮化合物含量,發現在3個發育時期,兩性花蕾中含氮量一直高于雄花蕾,且在性別分化中期差異達到最大。在性別分化前期、中期,兩性花蕾中含碳量低于雄花蕾；在性別分化后期,含碳量與雄花蕾相當?？梢?較小的C/N比值有利于蘆筍兩性花雌蕊的分化。

已有研究表明,蘆筍性別是由雌性抑制基因(SOFF)和雄性特異基因(aspTDF1)構成的“雙基因座模型”調控[14-15],除了這2個性別決定基因以外,有研究者認為在蘆筍兩性花中還存在一些性別修飾基因[16],這些基因受環境因子的影響[17]。同一兩性單株在不同年份不同季節開的花,其發育程度、結實性也存在一定的差異[5]。這些現象說明環境條件影響了與兩性花中性別修飾基因的表達。可變剪接能夠通過調節基因的表達,造成蛋白質組多樣性,從而對植物生長發育起著重要的作用[18]。本研究分析了蘆筍兩性花與雄花3個發育時期中基因的可變剪接,發現有86個氮化合物相關基因只在兩性花中發生了可變剪接,這些基因編碼核糖體蛋白、MADS-box轉錄因子和一些酶類物質等。核糖體是遺傳物質翻譯、合成蛋白質的場所。在荔枝雄花雌蕊原基的衰敗過程中首先是核糖體降解[19]。核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分,在植物胚胎發育、花器官發育尤其是雌配子體發育等方面發揮重要作用[20]。MADS-box基因也在植物花性別分化、花器官發育方面起著重要作用[21-23]。由此可見,蘆筍兩性花的性別分化、雄花的性別決定與核糖體蛋白基因、MADS-box轉錄因子等氮化合物基因相關。進一步分析發現在兩性花性別分化的前期、中期,分別有52,47個氮化合物代謝相關基因高表達,而在雄花中低表達。在兩性花性別分化后期,有38個氮化合物代謝相關基因表達量略高于雄花蕾。這與兩性花蕾中含氮量高于雄花蕾的差異一致。劉孟等[24]也發現蘆筍雌花發育過程中氮化合物多胺含量高于雄花,并認為高水平多胺與蘆筍雌性器官發育相關。這進一步表明氮化合物與蘆筍兩性花、雄花的發育密切相關。但含氮化合物相關基因調控兩性花發育的機理還有待深入研究。

綜上所述,蘆筍兩性花中性別決定基因可能直接或間接的調控了氮化合物代謝相關基因的表達,一方面通過可變剪接調節相關基因轉錄本的多樣性,另一方面通過改變相關基因的表達量,這些調控機制造成了兩性花中氮化合物含量高于雄花,最終使得兩性花與雄花的形態結構不同。研究結果不但揭示了蘆筍兩性花與雄花發育調控機制的差異,更為人為調控兩性花的形成提供了理論依據。