大豆異黃酮相關基因GmUGT73克隆及功能初步鑒定

王 俊，董海冉，常 宏，王 偉，包冬芳，趙孝岳，趙 雪，韓英鵬

(東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030)

大豆是我國重要的糧食作物和油料作物，也是我國人民植食性蛋白的主要來源[1]。異黃酮是一種黃酮類化合物，又稱植物雌激素[2]，包括游離型的大豆黃素、染料木素和黃豆黃素3種[3]，主要存在于大豆、菜豆、苜蓿等豆科植物中，其中以大豆的含量最高[4]。大豆異黃酮是大豆重要的次生代謝產物之一。它不僅參與調節植物的生長活動，還對人體健康具有重要作用。為了滿足市場對大豆異黃酮的需求，高異黃酮含量的大豆品種選育成為育種人員的重要目標之一。

異黃酮主要通過苯丙氨酸代謝途徑進行生物合成，這一途徑是從莽草酸途徑衍生的植物特有的次生代謝途徑，也是植物三大次生代謝途徑之一[5]。在自然狀態中，異黃酮以3種母核的形式存在，它們通過β-糖苷鍵和葡萄糖結合，形成異黃酮葡萄糖苷，在大豆中存在[6]。黃酮類色素等次生代謝產物的糖苷主要經過糖基化修飾，存在于植物天然次生代謝產物合成的最后一步[7]。UGT是存在于自然界中的一種重要修飾分子，UDP(尿嘧啶二磷酸腺苷)所活化的糖分子也能被UGT轉移到生物大分子上。UGT可修飾大豆中的黃酮類化合物，形成異黃酮糖苷，也是異黃酮的合成過程中的一類重要次生代謝產物[8]。目前，UGT基因已在多種植物(如水稻[9]、玉米[10]、蕎麥[11]、三花龍膽[12])中被研究，付曉雯[8]從葛根中成功克隆出具有糖基轉移酶活性的GT4基因，并驗證該基因可以影響大豆苷元、染料木素、黃豆黃素等物質的合成。李紅艷等[13]在丹參中成功克隆糖基轉移酶基因SmUF3GT，發現其可以將不穩定的類黃酮色素轉化為穩定類黃酮苷元。尤章[14]發現紫花苜蓿中MsUGT73B2基因影響黃酮物質的合成。Achnine等[15]發現蒺藜苜蓿GT99D基因參與合成黃酮類物質。而大豆糖基轉移酶基因功能尚鮮見報道。

本研究以高異黃酮品種中豆27為試驗材料，克隆GmUGT73全長序列并構建植物表達載體pCambia3300-GmUGT73，利用發根農桿菌介導大豆快速轉化技術來驗證GmUGT73基因與異黃酮含量的關系，進而為分子標記輔助育種提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

大豆品種：中豆27由中國農業科學院作物所培育；東農50由東北農業大學大豆研究所提供。

菌種和載體：K599發根農桿菌、pCambia3300載體、大腸桿菌DH5α感受態。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆總RNA提取及反轉錄 將大豆材料中豆27的種子種在12 cm×12 cm的小方缽中，缽中裝滅菌蛭石。將材料放置于16 h光和8 h暗，溫度(23±2)℃，濕度60%的光照培養箱內。待大豆幼苗第一輪三出復葉完全展開時，取葉片組織15～30 mg，置于液氮中，依照TRIzol的方法提取高異黃酮品種中豆27葉片的總RNA。采用東洋坊反轉錄試劑盒說明書進行操作，將RNA反轉錄成cDNA。

1.2.2GmUGT73的生物信息學分析 通過測序獲得了DNA序列，并且利用DNAMAN軟件將其翻譯氨基酸序列。利用ProtParam、ProtCcale、TMpred和MEMSAT-SVM在線軟件，可以對氨基酸的理化性質、親水性、疏水性、跨膜結構等指標進行初步分析，進而初步預測基因的功能。

1.2.3 RT-PCR法克隆GmUGT73全長基因 在Phytozomev 11.0數據庫查找GmUGT73基因的全長序列，GmUGT73CDS區域全長1 395 bp，根據GmUGT73基因的CDS序列設計引物(表1)，將cDNA作為模板DNA進行PCR擴增，反應體系和反應程序根據高保真DNA聚合酶(Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase)說明書進行操作。用瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法對目的基因片段進行電泳檢測。

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

1.2.4 目的片段回收 獲得的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈照射下，用解剖刀迅速切下含目的片段的瓊脂糖凝膠(質量一般小于0.3 g)，放入干凈的1.5 mL離心管中，利用膠回收試劑盒將目的片段進行回收，放入-20 ℃冰箱中保存。

1.2.5 表達載體構建與目的基因片段連接 在pCambia3300表達載體上找到單酶切位點，采用XbaⅠ酶，在37 ℃水浴鍋中5 h將其載體線性化，采用電泳的方法檢驗酶切結果。采用電擊法將目的片段與植物表達載體相連接，采用的大腸桿菌感受態DH5α是博邁德生物技術公司生產的。

1.2.6 菌液驗證及測序 利用PCR鑒定陽性克隆的方法，對菌液進行PCR檢測(Easy-Taq為PCR擴增酶)。將鑒定為陽性克隆的菌液送到測序公司測序。利用OMEGA公司生產的提質粒盒子(Plasmid Mini Kit(D6942-02*))對測序合格的樣品提取質粒。

1.2.7 大豆根部轉化與異黃酮含量測定 根據陳安樂[16]大豆發根轉化方法對GmUGT73基因以東農50為材料進行K599發根農桿菌轉化與侵染，對根部進行DNA提取，采用PCR鑒定的方法，并根據朱瑩等[17]液相色譜法(HPLC)測定異黃酮含量的方法，對大豆根部異黃酮進行測定。

2 結果與分析

2.1 GmUGT73基因的克隆與轉化

選取中豆27的第一輪完全展開的三出復葉提取總RNA，通過瓊脂糖電泳檢測，其中18S和28S條帶清晰可見(圖1)。通過Nanovue儀器對提取的總RNA進行濃度檢測，結果表明，RNA純度較高，完整性好，適合反轉錄成cDNA，進行基因克隆。

圖1 RNA電泳圖Fig.1 Agarosegel electrophoriesis of RNA

將中豆27的第一輪三出復葉總RNA逆轉錄成cDNA，并以其為模板、GmUGT73-R和GmUGT73-F為引物，經PCR反應后獲得目的片段，其長度為1 000～2 000 bp，與目的基因片段長度一致(圖2)，然后通過In-Fusion連接的方法將目的基因連接到植物過表達載體上。

對轉化大腸桿菌的菌液進行PCR陽性檢測(圖2)，將陽性克隆的菌液送至測序公司進行測序，下載全基因組基因序列與測序結果比對，將完全匹配的序列作為最終序列。

圖2 目的基因電泳圖Fig.2 Electrophoresis result of gene amplification

2.2 生物信息學分析

利用在線軟件對GmUGT73蛋白序列的一級結構進行分析，結果表明，GmUGT73基因的編碼區編碼464個氨基酸，分子質量為51.186 5 ku，理論等電點(pI)為6.27，其原子總數為7 176，其分子式是C2281H3580N608O685S22。在GmUGT73蛋白的氨基酸序列中，含量最多的是Leu，占總數的11.6%；不存在Pyl和Sec 2種氨基酸。GmUGT73蛋白質總正電和負電殘基數分別為37和41，蛋白不穩定系數為36.93，表明該蛋白相對比較穩定。GmUGT73蛋白GRAVY值為-0.111，脂溶指數為86.19，屬于親水性蛋白。蛋白質二級結構預測得到GmUGT73蛋白質中含有33.19% α-螺旋、41.59%片層結構、4.74% β-轉角、20.47%無規則卷曲。用在線軟件SWISS-MODEL預測中豆27中GmUGT73蛋白的三級結構(圖3)。

圖3 GmUGT73蛋白三級結構的預測Fig.3 Predict of 3-D structure of GmUGT73 protein

2.3 PCR鑒定發根農桿菌陽性克隆

用基因克隆引物對含有目的基因的發根農桿菌采取PCR陽性鑒定，結果顯示，菌液均為陽性克隆，代表目標轉化成功(圖4)。

2.4 轉基因陽性根鑒定

對接種20 d后的發根植株，隨機選取10株，提取根部中的DNA，采用PCR檢測的方法對其進行陽性鑒定，結果顯示其中9株為陽性(圖5)。

1.DL2000 Marker；2-6.5個不同單克隆菌液；7.水陰性對照； 8.大腸重組質粒pCambia3300-GmUGT73陽性對照。 1.DL2000 Marker；2-6.Five different monoclonal solutions； 7.Water negative control；8.E.coli plasmids pCambia3300-GmUGT73.

1-10.選取的10株發根植株；水.陰性對照；M.DL2000 Marker。 1-10.Chosen ten root plants；Water.Negative control；M.DL2000 Marker.

2.5 轉基因陽性根異黃酮含量測定

隨機選取5株轉基因陽性根，并將其與對照處理同等條件下采用高效液相色譜(HPLC)進行異黃酮相關含量的測量，結果顯示，轉基因陽性根中大豆苷元和大豆苷含量極顯著高于對照材料，其他組分無顯著變化，對2組數據進行差異性分析，差異達極顯著水平(P<0.01)，所以初步認定GmUGT73基因具有促進異黃酮合成的作用(圖6)。

1.對照大豆根系；2-6.轉基因陽性發根根系。不同大寫字母代表對照與轉基因根系之間異黃酮含量的差異極顯著(P<0.01)。 1.Control roots；2-6. Transgenic positive roots.Different capital letters represent extremely significant differences in isoflavone content between control and transgenic roots(P<0.01).

3 討論與結論

轉基因技術和基因編輯技術不斷提高，伴隨產生了更多的遺傳轉化方法和技術，給分子育種和定向改良作物性狀提供新思路。至今在植物中使用較多的方法有農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等，其中科研人員最為熱衷的是農桿菌介導法，主要是其價格成本低、耗時短[18]。采取發根農桿菌轉化的方法，可以影響次生代謝產物的合成[19]。證明發根農桿菌轉化在篩選異黃酮合成基因方面具有可行性。付曉雯[8]研究發現，葛根中異黃酮含量受到糖基轉移酶相關基因的影響。Baek等[20]研究發現，朝鮮黑莓中糖基轉移酶基因在類黃酮合成過程中發揮重要作用。本研究通過發根農桿菌介導法將GmUGT73基因轉入東農50品種中，獲得15個轉基因陽性根，用高效液相色譜法測定轉基因陽性根組織的異黃酮含量，驗證GmUGT73基因是否參與大豆異黃酮的合成過程。結果證明GmUGT73基因可能參與大豆異黃酮的積累過程。

大豆異黃酮多以苷元形式發揮生物功能，糖基化后其生理作用發生改變[21-23]。因此，糖基化對異黃酮組分的生物功能具有重要的作用。最早發現的大豆異黃酮特異UGT基因是GmIF7GT，它是在大豆幼苗中提取出來的[24]，它對異黃酮合成具有促進作用。后來Dhaubhadel等[25]發現UGT73F2糖基轉移酶基因可以促進染料木素和黃酮黃豆黃素合成，從而使黃豆黃苷和染料木苷的含量增多。本研究以中豆27為試驗材料，克隆出糖基轉移酶基因GmUGT73，連接pCambia3300過表達載體，通過K599轉化發根農桿菌，結果表明，發根中的大豆苷元(Daidzein)和大豆苷(Daidzin)含量增加，異黃酮含量顯著提高，這表明GmUGT73參與大豆異黃酮代謝過程。

通過RT-PCR方法從大豆中豆27中克隆獲得GmUGT73基因的CDS全長序列；GmUGT73基因編碼區編碼464個氨基酸，分子質量為51.186 5 ku，該基因編碼的蛋白比較穩定，親水性較強；成功構建pCambia3300-GmUGT73植物表達載體，發根農桿菌介導法轉化大豆東農50，獲得的轉基因陽性根中異黃酮含量和對照處理相比極顯著提高(P<0.01)，說明該基因可能具有合成大豆異黃酮的功能。