小麥抗壞血酸過氧化物酶TaAPX基因克隆與表達分析

王潤豪,于永昂,胡海燕,丁超杰,李紅民,牛晴晴,李成偉

(河南科技學院 生命科技學院,現代生物育種河南省協同創新中心,河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心,河南 新鄉 453000)

APX廣泛存在于高等植物、真核藻類及某些藍細菌中[5],由4個亞家族組成,分別涉及葉綠體、線粒體、細胞質和過氧化物酶體基因亞家族成員。有研究證明APX基因在植物響應逆境脅迫中具有重要的作用。李澤琴等[6]通過對植物APX的酶學特征、關鍵催化部位、基因表達調控分子機制以及對植物非生物逆境脅迫響應的途徑和生理功能的研究,揭示了該類酶在多種非生物逆境脅迫應答調控網絡中的重要作用。研究人員已在多種植物如擬南芥[7]、玉米[8]、水稻[9]、甘蔗[10]、棉花[11]等中分離到APX基因。多項研究證明,提高植物體內抗氧化酶類活性和增強抗氧化代謝水平是提高植物抗逆性的有效途徑之一。孫衛紅等[12]發現,通過在煙草中過量表達StAPX基因能夠有效清除H2O2,從而提高煙草的抗氧化脅迫能力。郁征宇等[13]通過實時熒光定量分析表明,SoAPX在菠菜各個組織器官中呈組成型表達,并在抗鹽、耐寒、抗旱以及抗氧化過程中起到重要作用。

小麥是我國主要的糧食作物之一,但高溫、干旱、冷凍和鹽堿等非生物脅迫嚴重影響其品質與產量,因此，提高小麥抵抗逆境的能力顯得分外重要。本研究利用生物信息學分析方法,在小麥全基因組中鑒定小麥APX家族成員,對其理化性質、基因結構、保守基序、蛋白質結構及細胞定位進行預測與分析,并構建系統進化樹,以分析該基因在不同物種間的進化關系；利用實時熒光定量技術分析TaAPX基因組織表達特異性以及對各種非生物脅迫響應的表達特性,為TaAPX基因的研究提供基礎資料,并為提高小麥對逆境脅迫的適應能力提供了一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料種植與處理

選取小麥品種百農207為試驗材料,由河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心保存。選取飽滿度一致的種子播種于苗盆中,以體積比例為1∶1∶3的蛭石、黃土、營養土為基質,置于人工氣候室中培養,光周期為16 h光照/8 h黑暗,溫度控制在25 ℃(光照) /16 ℃(黑暗),光照強度約為5 000 lx,濕度控制在65%左右。出苗后10 d,選取生長勢一致的幼苗,進行環境模擬脅迫,采用10 mmol/L的H2O2處理模擬氧化脅迫,通過添加濃度為200 mmol/L的NaCl溶液模擬鹽脅迫環境,通過20% 的 PEG4 000 處理模擬干旱脅迫條件,通過100 μmol/L的ABA處理模擬滲透脅迫條件,調節人工氣候培養箱的溫度模擬低溫脅迫(4 ℃)。分別脅迫0,1,3,6,12,24 h后用無菌剪刀剪取葉片,并用錫箔紙包裹經液氮處理后置于-80 ℃冰箱中保存,備用。

采集田間正常生長的健康小麥植株的幼根、幼葉、莖、葉鞘、莖節、雄蕊和雌蕊樣品,用錫箔紙包裹經液氮處理立即于-80 ℃冰箱保存,用于小麥RNA的提取、基因克隆、組織表達模式分析。

1.2 菌株與試劑

DNA凝膠回收試劑盒及質粒小量抽提試劑盒,均購自TIANGEN公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由河南省糧食作物基因組編輯工程技術研究中心提供；RT-qPCR試劑盒(TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus))、RNA 提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、pMD-19T載體、連接酶、限制性內切酶,均購自TaKaRa生物技術有限公司；DL2000+與DL5000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。引物由武漢金開瑞生物科技有限公司合成。其余化學試劑均為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥總RNA的提取和反轉錄 稱取0.1 g小麥幼苗的葉片,置于研缽中,迅速在液氮中研磨成粉末,依照TaKaRa試劑盒說明提取樣品總RNA。提取后,經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性和核酸蛋白分析儀測定其A260、A280值,檢測RNA濃度和純度。根據TaKaRa公司的PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成。

1.3.2TaAPX基因的擴增 根據GenBank中小麥APX基因(登錄號：EF555121)序列,采用Primer 5.0軟件設計P1引物對(表1),以小麥葉片cDNA為模板,PCR擴增TaAPX全長序列。PCR擴增反應體系為50 μL,包括10 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer(Mg2+plus)、4 μL 2.5 mmol/L dNTPs、2 μL 10 μmol/L正向引物、2 μL 10 μmol/L反向引物、1 μL PrimeSTAR GXL DNA polymerase(TaKaRa,R050A)、5 μL cDNA模板和26 μL ddH2O。PCR程序為：94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s,58 ℃ 1.5 min,32個循環；72 ℃ 7 min。PCR擴增產物經凝膠回收試劑盒回收并與 pMD-19T 載體連接,構建重組質粒轉化E.coliDH5α感受態細胞,篩選陽性克隆,送至深圳華大生物技術有限公司測序。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.3TaAPX基因的生物信息學分析 利用 NCBI ORF finder確定該基因的開放閱讀框；用NCBI的CDS(Find conserved domains)尋找保守區,預測蛋白質家族；利用ProtParam分析TaAPX蛋白質的基本理化性質。運用TMHMM 2.0 Server分析TaAPX跨膜結構；利用ClustralW和DNAMAN軟件對不同物種APX蛋白氨基酸序列進行比對與分析,采用Neighbor-joining方法,構建不同生物APX基因系統進化樹,用以分析不同物種之間的進化關系。

1.3.4TaAPX基因表達特性分析 提取小麥百農207幼根、莖、幼葉、莖節、葉鞘、雌蕊、雄蕊的RNA以及不同非生物逆境脅迫不同時間后葉片的RNA,參照1.3.1方法檢測RNA濃度和純度,根據反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈的合成,合成后將cDNA質量濃度調至50 μg/μL。依據所克隆的APX基因的編碼序列設計定量PCR的引物(P2),以Actin作為內參基因(P3),根據TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行實時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR),取384孔PCR板置于冰上,依次加入TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA(50 μg/μL)2 μL、ddH2O 6 μL,共20 μL,盡可能在弱光下配制以上體系。qPCR反應在QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR儀中進行,擴增標準程序：預變性95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 30 s,40個循環；獲取熔解曲線(95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s)。生物學重復和技術重復各3次,利用 Opticon Monitor 2.02軟件進行保存和分析,利用2-ΔΔCt方法分析TaAPX基因在小麥不同組織部位的表達水平和逆境脅迫下的表達特性。

1.4 數據處理

用 Excel 2010進行數據處理,所有數據采用SAS 8.0進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 TaAPX基因的克隆與生物信息學分析

以小麥葉片cDNA為模板,采用PCR進行目的基因擴增,擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示,擴增得到與目標片段大小一致(約900 bp)的條帶(圖1)。測序結果表明,該序列全長923 bp。經ORF finder預測,發現該序列具有完整的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),長876 bp,編碼291個氨基酸(圖2),將此序列命名為TaAPX。通過ProtParam分析其理化性質,推測TaAPX蛋白的分子式C1417H2246N394O423S5,分子質量為31.73 ku,理論等電點pI為7.74。理論推導其半衰期大約為30 h,不穩定參數為31.14,蛋白質性質穩定,脂肪指數為87.90,總平均親水性為-0.264,介于-0.5～0.5,推測其可能是兩性蛋白,其親/疏水信號如圖3,

M.DL5000 bp DNA Marker; 1.cDNA的PCR產物。 M.DL5000 bp DNA Marker; 1.PCR product of cDNA.

其中第275位點具有最高分值,為3.167,疏水性最強,第234位點具有最低分值為-2.744,親水性較強。TaAPX中的酸性氨基酸(Asp+Glu)39個,堿性氨基酸(Arg+Lys)40個。采用SingalP進行信號肽預測顯示,APX的氨基酸序列無信號肽位點,屬于非分泌性蛋白質。用TMHMM 2.0 Server分析TaAPX跨膜結構,結果顯示,TaAPX蛋白序列的第262-284位具有一跨膜區(圖4)。對TaAPX蛋白的氨基酸序列用NCBI的CDS(Find conserved domains)尋找保守區(圖5),發現其含有APX蛋白家族的保守序列,屬于植物類POD超家族。

圖2 小麥TaAPX基因開放閱讀框序列和其推導的氨基酸序列Fig.2 ORF sequence and predicted amino acids sequence of TaAPX gene

圖3 TaAPX蛋白親疏水性分析Fig.3 Hydrophilictity/hydrophobicity prediction of TaAPX

圖4 TaAPX蛋白的跨膜區分析Fig.4 Transmembrane domain prediction of TaAPX

圖5 TaAPX蛋白保守區預測Fig.5 Conserved domain prediction of TaAPX

2.2 TaAPX基因的進化關系分析

將小麥TaAPX基因編碼的氨基酸序列進行BlastP比對,發現其與大麥(Hordeumvulgare,AXF50251)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,XP_003574893)、水稻(Oryzasativa,XP_015650808)、玉米(Zeamays,NP_001132505)、谷子(Setariaitalica,XP_004974146)、高粱(Sorghumbicolor,XP_002446119)和柑橘(Citrussinensis,XP_006486751)APX基因編碼的氨基酸序列相似性分別為97.25%,93.47%,91.07%,89.69%,89.00%,73.54%和77.66%,說明APX具有較高的保守性(圖6)。通過MEGA 5.0中的ClustalW比對,采用Neighbor-joining方法,構建了不同物種APX基因進化樹。結果表明,小麥APX基因與大麥親緣關系最近 (圖7) 。

圖6 小麥TaAPX編碼氨基酸序列與其他物種APX編碼氨基酸序列比對Fig.6 Multiple alignment of amino acid sequences coded by TaAPX and other plant APX

2.3 小麥TaAPX基因在各組織中的表達模式

基于實時熒光定量PCR技術,利用TaAPX基因特異引物進行組織特異性表達分析,分析了TaAPX在小麥幼根、莖、幼葉、莖節、葉鞘、雌蕊、雄蕊不同組織中的相對表達量。以莖的表達量為參照基準,結果表明(圖8),小麥TaAPX基因在所檢測部位中均有表達,但其表達量差異較大。在幼葉中表達最高,顯著高于其他組織(P<0.05)；其次是莖、莖節；在幼根、葉鞘中表達量較低,幼葉中的表達量分別是幼根和葉鞘的16.69,37.33倍；在雄蕊和雌蕊中幾乎不表達,表達量顯著低于幼葉、莖、莖節(P<0.05)。

圖7 TaAPX基因的遺傳進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of TaAPX

不同字母表示差異顯著性(P<0.05)。 Different letters indicate significant differences(P<0.05).

2.4 小麥TaAPX基因對非生物脅迫響應的表達分析

采用高鹽、干旱、低溫、H2O2、ABA等5種非生物脅迫處理小麥,可以較全面地反映TaAPX基因在非生物脅迫中的應答機制。RT-qPCR結果表明(圖9),TaAPX基因對以上5種逆境脅迫均有應答,但是表達模式存在明顯差異。干旱處理下(圖9-A),TaAPX的響應較為強烈,隨著脅迫處理時間的延長,TaAPX表達量呈現2次先增高后降低的趨勢,并在12 h時表達量達到最高峰,上調到對照組的2.19倍。在低溫處理下(圖9-B),隨著脅迫處理時間的延長,TaAPX基因表達量呈先降低然后增高到最高峰之后降低再增高的趨勢,經低溫處理1 h后,TaAPX的表達被抑制,處理 3 h 后上調達到高峰,表

圖9 小麥TaAPX基因對非生物脅迫響應的表達分析Fig.9 Expression analysis of wheat TaAPX gene in response to abiotic stress

達量為對照組的1.81倍,隨后又呈下降趨勢。在H2O2處理條件下(圖9-C),表達量呈先下降然后再上調的趨勢。在ABA處理條件下(圖9-D),表達量呈現先下調后上調再下調的趨勢。在鹽脅迫處理下(圖9-E),TaAPX基因表達量顯著下調,1～24 h基因下調的表達量差異不顯著。綜上表明,TaAPX基因的表達受干旱、低溫等逆境的誘導或抑制,可能與小麥抵御非生物脅迫有密切的關系。

3 結論與討論

本研究從小麥中分離到一個抗壞血酸過氧化物酶基因TaAPX,開放閱讀框長876 bp,編碼291個氨基酸。TaAPX氨基酸序列無信號肽位點,推測其為非分泌蛋白,氨基酸序列與大麥相似度達97.25%。TaAPX為組成型表達基因,在小麥各組織中均有表達,但表達量在幼葉最高,雌蕊、雄蕊中最低。在非生物脅迫條件下,盡管TaAPX表達量變化特點存在差異,但表現出對干旱、低溫等脅迫的顯著性響應。

在鹽漬、干旱、高溫、低溫等逆境條件下,由于細胞代謝過程不協調會導致各種活性氧的升高,從而造成氧化脅迫,并通過脂質過氧化和蛋白質氧化作用損傷DNA 以及其他細胞成分,對植物細胞造成嚴重的傷害[14]。ROS具有雙重功能：一方面適量的活性氧為生物體所必須,作為信號分子參與信號網絡調控；另一方面,過量的活性氧對細胞有毒害作用,這些活性氧若不及時清除,會氧化各種細胞組分,導致細胞的破壞[15-16]。因此,平衡細胞內活性氧產生和清除尤為重要,植物會通過酶或非酶機制維系機體活性氧的動態平衡,并在進化過程中形成了完整的抗氧化系統[17]。APX作為清除活性氧的關鍵組分,具有在非生物脅迫下清除和防御活性氧自由基的功能,增強植物抗性,保護植物細胞免受氧化傷害,在細胞 H2O2代謝過程中起著至關重要的作用。因此,研究小麥APX基因功能對提高小麥抗非生物脅迫具有現實性意義。

目前，已從玉米、大麥、高粱、煙草、水稻、菠菜、百合等多種植物中分離獲得APX基因的cDNA,本研究克隆獲得的小麥TaAPX基因開放閱讀框為876 bp,編碼291個氨基酸。通過氨基酸序列比對及系統進化樹分析,TaAPX基因與大麥APX基因編碼蛋白的氨基酸全長序列相似性達到97.25%,親緣關系最近,推測兩基因可能在調控植物生長方面的功能比較接近;預測分析顯示,TaAPX可能是兩性蛋白,無信號肽,為非分泌蛋白,而高粱APX蛋白也不含信號肽,疏水性弱,與TaAPX蛋白氨基酸序列同源性為73.54%,推測兩者可能屬于APX基因家族具有相同功能的成員[18]。

在大多數禾本科植物中,抗逆基因在各器官中均有表達,但表達模式存在差異,同時非生物脅迫對這些基因的表達有顯著性影響[19-23]。本研究結果表明,小麥TaAPX基因在各個組織均有表達。其他研究證明,枸杞APX在根、葉片、葉柄等組織中具有表達特異性,并且在葉中表達量最高[24],菠菜SoAPX2基因在各個組織均有表達,在葉中的表達量比根中高很多[13],與本研究結果一致。小麥中TaAPX基因表達呈現出明顯的組織特異性,其在幼葉中的表達量最高,在雌蕊、雄蕊中表達較低。小麥TaAPX應答不同非生物脅迫的表達量分析結果表明,TaAPX對低溫、干旱、鹽害、ABA、H2O2等非生物脅迫均有響應,在不同脅迫中呈現不同的響應情況。TaAPX在PEG處理12 h表達量達到最大,之后降低；在低溫脅迫3 h表達最強,之后降低,表明TaAPX對低溫、干旱響應較為顯著。許多研究報道,APX參與多種逆境脅迫,可以提高植物在逆境脅迫條件下的抗性,例如水稻OsAPX8經RNAi沉默后比非轉化植物對缺水更敏感,說明APX是抗旱性基因[25-27]；在擬南芥APX家族基因中,APX1、APX3、APX5、APX6對鹽、干旱脅迫有顯著響應[7]；Yan等[28]發現,過表達AtAPX3的煙草在適度干旱條件下種子產量增加。說明APX基因在不同作物中行使同樣的抗旱功能。在甘薯[29]、番茄[30-31]幼苗中表達APX基因可提高APX的活性,顯著增強植株的耐低溫和抗寒能力,表明APX基因參與植物響應和耐受低溫脅迫；在擬南芥植株中轉入大麥pAPX基因,轉基因植株增強了對鹽的耐性[32]；過量表達GhAPX基因提高了中林美荷楊耐鹽性[33]；過量表達葉綠體APX基因,可提高棉花PSⅡ光化學活性和抗氧化能力[34]。一系列研究證明,APX基因參與多種非生物脅迫環境響應,而本研究結果顯示,APX基因對鹽脅迫和滲透脅迫響應的表達量較低,可能由于不同作物種類原因,APX基因的功能有不同的針對性,進一步驗證APX在不同作物中對非生物逆境脅迫的耐受能力不同。

本研究從小麥中克隆獲得TaAPX基因,對進一步研究小麥APX基因生理功能及其相關的抗氧化機理提供了基礎。下一步將構建過表達載體和干擾載體,通過轉基因進一步研究該基因在小麥抗寒、抗旱、抗氧化等方面中的具體作用。依據該基因相關信息，利用分子育種手段可以提高小麥抗非生物脅迫的能力并進行品種改良。