克里本類芽孢桿菌PS04誘導水稻抗病相關基因的表達分析

程 妍，曲瑋茵，鄭文博，楊 媚，廖美德，周而勛，舒燦偉

(華南農業大學 農學院，廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642)

由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn AG1-IA)引起的水稻紋枯病是世界性的水稻病害之一[1]。近年來，隨著水稻矮稈多蘗品種的密植以及氮肥過量施用等原因[2]，水稻紋枯病逐漸成為危害水稻生產的第一大病害[3]，每年可導致數億公斤水稻產量的損失，嚴重時可以使水稻減產50%，甚至絕收[4-5]?；瘜W防治由于其具有經濟高效、防治簡便等優點一直被用于防治水稻紋枯病。但是，過度使用化學藥劑引發了眾多隨之而來的問題，如環境污染、紋枯病菌耐藥性增強等。因此，開發廣譜、高效、低毒、環保的微生物農藥用于防治水稻紋枯病迫在眉睫。

近年來，植物病害的生物防治引起了廣泛的關注，研究者也對植物潛在的抗病機理進行了探索。植物與病原生物在長期互作、協同進化中逐漸形成了一系列防衛機制，即植物受物理、化學或生物方法處理后，對隨后某種或某些病原物的侵染所產生的誘導抗病性。壞死型病原物侵染或某些生化制劑誘導處理后，植株未受侵染或處理部位產生對隨后病原物侵染的抗性，稱為系統性獲得抗性(Systemic acquired resistance，SAR)[6]，這種抗性是在水楊酸(Salicylic acid，SA)以及病程相關蛋白(Pathogenesis-related proteins，PR蛋白)的積累后誘發的。NPR1(Nonexpressor of PR genes 1)基因是控制SA積累的關鍵基因[7]，能夠激活多種抗病相關基因(PR1等)的表達，提高植物的抗病性[8]。另一種與SAR相似的抗性表型可以被一些非致病性的細菌刺激，稱為誘導性系統抗性(Induced systemic resistance，ISR)[9-10]。與SAR不同，ISR是由茉莉酸和乙烯(Jasmonic acid/ethylene，JA/ET)信號傳導途徑介導的[11-12]。

目前已有很多報道表明，生防菌可以誘導植物產生SAR或ISR從而提高植物對病原菌的抗病性。在水稻中，陳志誼等[13]報道了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Bs-916可以誘導苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗病性有關的酶類活性大幅度提高，從而控制水稻紋枯病(R.solani)和稻曲病(Ustilaginoideaoryzae)的發生[14]。戴秀華[15]研究發現，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)Lx-11能夠誘導PR4、PR10a、LOX等基因的表達以及過氧化物酶(POD)、SOD等抗氧化酶活性的變化，從而起到防止水稻細菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzae)侵染與蔓延的作用。近年來，Rais等[16]也報道了芽孢桿菌(Bacillusspp.)KFP-5等菌株可以誘導水稻體內SOD和POD等抗氧化防御酶活性的提高，從而降低稻瘟病(Pyriculariaoryzae)的發病率。

在其他作物中，Viswanathan等[17]報道了甘蔗根際促生菌株可誘導甘蔗對鐮刀菌的抗病反應，經處理后甘蔗組織中幾丁質酶、POD等防御酶的水平顯著提高。Sharma等[18]研究發現，惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)CRN-09和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)CRN-16能夠協同誘導綠豆的系統抗性，從而抑制了殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)的侵染。Droby等[19]發現了假絲酵母菌(Candidaoleophila)能誘導葡萄柚的系統性抗性，抑制果實采后腐爛病菌青霉菌的孢子萌發和芽管生長。除了生防菌本身的直接誘導作用，其產生的活性物質同樣可以誘導植物的抗性。芽孢桿菌(Bacillussp.)JS菌株的揮發物通過激活PR基因的表達并誘導煙草植株產生系統抗性[20]。棘孢木霉(Trichodermaasperellum)T-34菌株產生的揮發性化合物可以局部觸發根系中鐵穩態的重新調整，通過啟動依賴于JA的防御系統從而誘發植物產生ISR[21]。

根據梁小文等[22]之前的報道，克里本類芽孢桿菌(Paenibacilluskribbensis)PS04可以抑制水稻紋枯病菌的生長并激發水稻的系統誘導抗性[23]，其發酵液的最高防治效率達93.65%，粗代謝產物的最高防治效率為73.85%[24]。在國家重點研發項目的支持下，熱帶與亞熱帶真菌研究室利用該菌株制備成了生防菌劑，在廣東省內的水稻生產基地進行了大面積的推廣示范，取得良好的田間防病促生效果，但有關該菌對水稻的誘導抗病機理和抗病途徑的調控還不清楚。因此，本研究的目的是揭示在克里本類芽孢桿菌處理下水稻抗病相關基因表達的動態變化，并確定該菌誘導寄主產生抗病性的途徑。

1 材料和方法

1.1 PS04發酵液的制備

將PS04菌株接種到LB液體培養基中活化，將活化好的種子培養液，按5%的比例接種到改良查氏培養液(3%蔗糖，0.15% NaNO3，0.1% K2HPO4，0.05% MgSO4，0.05% KCl，0.001% FeSO4)中，在30 ℃條件下以180 r/min培養84 h得到發酵原液。發酵原液稀釋200倍后用于噴施水稻。

1.2 水稻的種植和處理

將水稻(品種9311)催芽后播于白色的箱中，每盆6排，每排10株，共播15盆。待稻苗長至三葉一心期時進行人工噴施處理，接種菌液量為100 mL/盆，以清水噴施為對照。以不處理的樣本為0 h。噴施24 h后開始計時取樣，再按3，6，9，12，24 h分別采集葉片，立即投入液氮中，于-80 ℃冰箱保存。

1.3 cDNA第一鏈合成及實時熒光定量PCR

采用Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa，中國，大連)提取水稻葉片的總RNA，用DNase Ⅰ(TaKaRa，中國，大連)處理后，用反轉錄試劑盒PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，中國，大連)進行反轉錄。實時熒光定量PCR(Real-time PCR)在Bio-Rad熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國，加利福尼亞州)上進行反應。Real-time PCR反應程序為：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，退火溫度15 s，72 ℃延伸10 s，40個循環。每個樣品3個技術重復和3個生物學重復。本研究所用引物序列如表1所示。相對表達量的計算用2-ΔΔCt方法進行分析，以水稻Actin基因為內參。顯著性分析用SPSS 23軟件(IBM，美國，紐約)進行。

表1 使用的PCR引物序列Tab.1 Sequences of all PCR primers used in this study

2 結果與分析

2.1 PS04誘導PR途徑基因表達

RT-qPCR結果表明，PS04菌株發酵液能夠誘導水稻防衛反應基因OsPR1、OsPR2、OsPR3、OsPR4、OsPR5、OsPR10和OsPR16的表達。OsPR1基因在第9小時表達量最高隨后下降；OsPR2基因在9 h表達量較高，此后緩慢降低，到24 h表達量達到最大值；OsPR3、OsPR4、OsPR5和OsPR16基因從3 h逐漸升高至6 h出現峰值，隨后急劇下降；OsPR10基因從9 h升高至12 h表達量最高隨后急劇下降；NPR1基因在第3小時表達量最高隨后急劇下降(圖1)。但本研究發現，水稻的OsPR6、OsPR8、OsPR9、OsPR13和OsPR14基因均不表達。

2.2 PS04誘導SA途徑基因表達

RT-qPCR結果表明，PS04菌株發酵液能夠誘導基因PAL和OsNAC4的表達。PAL基因在6 h表達量急劇升高到最大值隨后急劇降低；OsNAC4基因從3 h逐漸升高至9 h出現峰值，在此后緩慢降低，但直到24 h的表達量仍顯著高于對照(圖2)，說明生防菌對水稻誘導抗性作用與水楊酸合成途徑有關。

2.3 PS04誘導JA途徑基因表達

RT-qPCR結果表明，PS04菌株發酵液能夠誘導LOX基因的表達。AOS2基因在未噴施菌株發酵液時表達很高，噴施后表達受到抑制，表達量從3 h逐漸升高至6 h出現高峰，在此后急劇下降，且直到24 h的表達量與對照相比均顯著降低，這說明該基因的表達是受到抑制的；LOX基因在3 h時表達量急劇升高到峰值隨后急劇下降(圖3)。這些結果表明，該菌對水稻誘導抗性作用與茉莉酸合成途徑也有關，發揮主要誘導作用的是LOX基因。

圖1 PS04誘導水稻PR途徑基因表達Fig.1 Effect of PS04 on the expression of PR pathway genes in rice plant

圖2 PS04誘導水稻SA途徑基因表達Fig.2 Effect of PS04 on the expression of SA pathway genes in rice plant

2.4 PS04誘導ET途徑基因表達

RT-qPCR結果表明，EIN2基因在3 h與對照相比顯著降低，3 h后逐漸升高至9 h出現小高峰，此后緩慢降低，但到24 h的表達量達到最大值，且與對照相比仍然顯著升高(圖4)。結果表明，生防菌對水稻誘導抗性作用與乙烯合成途徑有關。

圖3 PS04誘導水稻JA途徑基因表達Fig.3 Effect of PS04 on the expression of JA pathway genes in rice plant

圖4 PS04誘導水稻ET途徑基因表達Fig.4 Effect of PS04 on the expression of ET pathway gene in rice plant

3 討論

本研究利用熒光定量PCR技術對水稻應答克里本類芽孢桿菌PS04處理后誘導抗性相關基因的表達譜進行表達分析。本研究結果發現，PS04菌株誘導了水稻防衛反應基因OsPR1、OsPR2、OsPR3、OsPR4、OsPR5、OsPR10、OsPR16的表達，說明克里本類芽孢桿菌對水稻具有誘導抗性作用。但對于水稻抗性基因的誘導具有明顯的時間特性，推測其原因是PS04菌株誘導一定時間后相關抗性基因表達水平逐步達到峰值，抗病水平也達到最高，但隨著時間的推移，生防菌在植物體內的濃度逐漸下降直至消失，誘導的抗病性水平也隨之下降[25]。NPR1被認為是SA和JA途徑交叉的關鍵節點，是植物系統性抗性的重要調節中心。NPR1基因在細胞核內的積累是誘導水楊酸(SA)介導的PR基因表達和SAR產生的充分必要條件。NPR1通過與TGA轉錄因子相互作用調控PR基因表達。本研究發現NPR1基因在3 h時表達量最高，隨后表達量迅速下降，PS04處理可以很快誘導NPR1的表達。在其他研究中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)PTS-394誘導番茄抗病信號通路節點基因NPR1在24～72 h得到了顯著表達；煙草的NPR1基因在枯草芽孢桿菌(B.subtilis)OKB105處理12 h后有明顯的表達[26]；普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)A21-4處理辣椒后體內的NPR1基因從第3天顯著增加到第7天表達量達到最大[27]。因此本研究發現，克里本類芽報桿菌誘導水稻的NPR1基因顯著表達的時間是接種后3 h，這個時間點比其他菌株報道的時間快，說明噴施PS04后，水稻的抗性相關基因很快就被調動起來。

JA通常與ET協同發揮其刺激抗性的作用，ET/JA信號會對SA信號通路產生負向影響，從而微調植物的防御反應。本研究選取了2個SA途徑相關基因PAL、OsNAC4進行表達分析，結果顯示，PAL基因在6 h時表達量達到最大值，隨后急劇降低；OsNAC4基因在9 h時表達量最高隨后下降。這2個基因的表達量變化受到克里本類芽孢桿菌顯著誘導，說明克里本類芽孢桿菌是通過SA途徑起誘導抗性的作用。JA合成途徑開始于α亞麻酸，LOX和AOS是該途徑的2個重要的基因。本研究發現，受克里本類芽孢桿菌處理后，LOX基因在3 h時表達量最高隨后急劇下降，說明克里本類芽孢桿菌也通過JA途徑起作用。張榮勝[28]的研究也發現，噴施解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliguefaciens)Lx-11 24 h后水稻植株中PAL和NPR1基因的表達量達到最大值，隨著時間的增加，基因表達水平有所降低，LOX基因的表達水平也有所提高。因此本研究發現，克里本類芽孢桿菌可能是通過JA途徑介導的誘導抗性。綜上，本研究的結果表明，克里本類芽孢桿菌可以同時誘導水稻的SAR和ISR途徑基因的表達，從而提高了水稻的抗病性。