IL-8基因型多態性及其表達水平對鼻咽癌易感性的診斷價值

潘國剛, 楊碧秀, 王春芳, 許桂丹, 梁麗娜, 龍紅兵, 鄧益斌

(右江民族醫學院附屬醫院, 廣西 百色 533000)

鼻咽癌( Nasopharyngeal carcinoma, NPC)在頭頸部腫瘤中最為高發，據世界衛生組織的報道，中國占全球NPC發病率的40%，在臨床工作中，由于NPC發病隱匿，大部分確診時已處于中晚期，易轉移復發風險高，死亡率急劇上升[1,2]，因此提高早期NPC診斷率及預后的判斷尤為重要。有關NPC的生物標志物，中國抗癌協會的腫瘤標志專業委員會專家推薦將血漿EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)DNA 檢測作為NPC早期篩查、治療方案制定及預后判斷的重要指標[2]。既往研究表明除EBV外，包括血清乳酸脫氫酶、C反應蛋白、甲基化標志物、白細胞介素-8(Interleukin-8 ，IL-8)等可作為NPC特異性的生物免疫標志物，其中IL-8是一種由巨噬細胞、上皮細胞、氣道平滑肌細胞、內皮細胞、腫瘤細胞等多種細胞所產生的一種趨化因子，是多種癌癥發生發展的重要免疫調節因子[2]。IL-8的表達水平與NPC的發生和轉移密切相關發生，作為中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞的趨化因子，在急性炎癥反應的發生和遷移中起著關鍵作用[3,4]。而IL-8基因寡核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)在NPC患者中的研究結果尚不清楚[3,5]。本文通過NPC患者進行病例對照研究，評估IL-8 SNPs及其表達水平對NPC易感性的診斷價值，為臨床更精準的治療NPC患者提供靶向治療位點。

1 資料與方法

1.1一般資料:收集我院住院的NPC患者168例，以及同期體檢健康人群232例為對照組，納入標準：病理檢測確診為鼻咽癌，所有患者進行放、化療治療，血化驗診療資料完整；排除標準：存在其他系統疾病，如心腦肺、血液系統疾病，嚴重感染、風濕免疫感染疾??；收集所有研究對象的臨床及病理資料，包括年齡、性別、吸煙、飲酒、EBV感染情況。

1.2IL-8基因型多態性及血清IL-8表達水平檢測:抽取所有研究對象的血液樣本，應用試劑盒提取DNA，利用聚合酶鏈反應-限制片段長度多態(PCR-RFLP)方法對IL-8基因-251、+781、+1633及+2767位點進行基因分析，引物序列為：IL-8-251位點：正向：5'-TCATCCATGATCTTGTTCTA-3'，反向： 5'-GGAAAACGCTGTAGGTCAGA-3'， IL-8+781：正向5'-CTCTAACTCTTTATATAGGA-3'， 反向5'-GATTGATTTTATCAACAGGC-3'，IL-8+1633：正向5'-CTGATGGAAGAGAGCTCTGT-3'，5'-TGTTAGAAATGCTCTATATT-3，IL-8+2767：正向5'-CCAGTTAAATTTTCATTTCA-3'，反向 5'-CAACCAGCAAGAAATTACTA-3'，PCR循環條件為：94℃預變性5min，循環1次；94℃ 變性30s，35個循環；55℃退火30s，72℃延伸30s；最后在72℃延長10min；IL-8-251、IL-8+781、IL-8+1633 和IL-8+2767位點的長度分別為524bp、203bp、397bp、222bp，分別用MfeI、EcoRI、NlaII、BstZ17I限制性內切酶消化，在2%瓊脂糖上電泳跑膠，條帶分別為(449bp、75bp)、(184bp、19bp)、(234bp、163bp)、(198bp、24bp)，挑取正確條帶進行測序分析[3]；血清IL-8表達水平檢測應用酶聯免疫吸附法(ELISA)進行IL-8水平檢測，具體步驟參照IL-8檢測試劑盒嚴格進行(武漢云克隆科技股份有限公司，SEA080Hu)，收集鼻咽癌患者血液血清，加入到提前包被IL-8抗體的96孔酶標板中，用生物素標記的抗體孵育1h，HRP標記孵育30min，最后用酶標儀測96孔內的吸光度。

1.3統計學分析:應用SPSS21.0軟件進行分析。計數資料以均數±標準差表示，行t檢驗；計量資料以(%)表示，行χ2檢驗；以多因素logistic回歸分析比較IL-8 SNPs與NPC易感性的關系，關聯強調用優勢比(OR)和95%置信區間(95%CI)及交互作用指數表示，S>1為正交互，S<1為負交互，利用工作特征性曲線(ROC)評價IL-8表達水平在NPC的診斷價值。以P<0.05為統計學意義。

2 結 果

2.1兩組間一般資料比較:鼻咽癌組(NPC組)168例，健康對照組(NC組)232例，兩組患者在年齡、性別、飲酒等方面差別無統計學意義(P>0.05)，兩組在吸煙、EBV感染差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2兩組間IL-8基因型分布、等位基因頻率及IL-8表達水平比較:IL-8 -251位點3種基因型(TT、TA、AA)中TT和TA基因型在NPC中顯著升高，AA基因型在NPC中顯著降低，差異有統計學(P<0.05)，而等位基因T和A在兩組間差別無統計學意義(P>0.05)；IL-8+781位點3種基因型(CC、CT、TT)、IL-8+1633位點3種基因型(CC、CT、TTT)、IL-8+2767位點3中基因型(AA、AT、TT)及其相應的C/T、C/T、A/T等位基因，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)；IL-8在NPC的表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 兩組間人口學資料特征比較

表2 兩組間IL-8基因型等位基因頻率及表達水平比較

2.3IL-8-251位點與NPC易感性的多因素logistic回歸分析:IL-8-251位點攜帶TT基因型(OR=1.98，95%CI：1.00～3.82)和TA基因型(OR=1.35，95%CI∶1.01～2.61)患NPC的風險顯著升高，而攜帶AA基因型(OR=1.76，95%CI：1.02～3.08)患NPC的風險顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 IL-8-251位點基因型與NPC易感性多因素Logistic回歸分析

2.4IL-8-251基因型多態性在不同因素暴露下對NPC易感性的交互作用分析:IL-8-251位點SNPs與在吸煙、EBV感染因素下對NPC易感性存在交互作用，該位點與吸煙(S=0.91)、EBV感染(S=0.82)存在負交互作用，見表4。

表4 IL-8-251基因型位點SNPs與不同因素在NPC發生中的交互作用

2.5IL-8水平對NPC的診斷價值:根據血清IL-8水平對NPC的診斷價值繪制ROC曲線，IL-8水平的的曲線下面積(AUC)為0.852，其敏感性為86%，特異性為78%，見圖1。

圖1 IL-8水平對NPC診斷價值的ROC曲線

3 討 論

NPC發病機制十分復雜，目前病因尚不明確，多為EBV感染及環境因素共同作用的結果，盡管影像學檢查對于NPC的診斷具有特異性，但血漿EBV DNA篩查仍是NPC診斷的金標準[6,7]。隨著影像成像技術的發展，個性化的綜合放化療策略有助于提高生存率，降低毒副作用，廣泛應用于人群篩查、預后預測和疾病監測，免疫治療作為一種新型治療方法在多種晚期惡性腫瘤的治療中發揮著重要作用，已成為除手術、放化療外的另一種重要的治療手段，在NPC中具有廣闊的應用前景[8～10]。

腫瘤組織中的癌細胞以及癌旁組織的免疫細胞等間質細胞，都會釋放細胞因子。IL-8又稱為趨化因子CXCL8，是上皮細胞和巨噬細胞等分泌的細胞因子。研究表明IL-8基因及SNPs與包括鼻咽癌在內的的多種人類惡性腫瘤的發生發展過程中發揮潛在作用，可作為免疫治療的靶點[11]。IL-8在多種癌組織中高表達，IL-8過表達可導致疾病進展，在低氧微環境下，IL-8作為一種趨化因子，對多種細胞具有趨化及激活作用，在炎癥、免疫反應中起到重要的作用，同時也是一種促血管生成因子，可促進腫瘤細胞、內皮細胞及中性粒細胞增殖、存活和逃脫程序性細胞死亡及侵襲、擴散、遷移[3]。 IL-8基因的表達可通過以下途徑：①與多種轉錄因子相互作用來調節其表達；②參與翻譯階段細胞蛋白的合成；③參與蛋白的翻譯后調節作用，可激活IL-8通路相關上下游序列。IL-8基因位于人類基因組的4q12-q13，由4個外顯子組成，IL-8基因寡核苷酸多態性(SNPs)，即啟動子區域-251 T/A、+781 C/T、+1633 C/T和+2767 A/T是否影響IL-8的表達，以及與NPC的易感性研究，目前研究較少，本研究擬探討IL-8基因型多態性及其表達水平對NPC患者易感性的診斷價值，以期臨床早期診斷及治療NPC患者。

在本研究中，我們發現IL-8啟動子-251 T/A 基因型與NPC易感性有關，IL-8-251位點攜帶TT基因型和TA基因型患NPC的風險顯著升高，而攜帶AA基因型患NPC的風險顯著降低， 在啟動子區域(251A/T)發生突變，可影響IL-8 基因的轉錄異常，導致IL-8基因表達下降，提示IL-8可能介導感染炎癥作用引起NPC疾病的發生發展，本研究的結果與以往研究存在不一致[3,7]，可能歸因于不同的人群，不同的暴露因素，或相對較小的樣本量，未來的研究需要進一步擴大樣本來驗證該位點多態性與NPC的發生的關聯性在本研究亦發現NPC患者中IL-8表達升高，考慮其與NPC疾病進展有關，且對NPC的易感性具有診斷價值。據報道，慢性吸煙和EBV感染是鼻咽癌發生的病因，降低了患者的生存率[12]，與本研究報道一致，在NPC人群中患者吸煙、EBV感染明顯增多，可能與NPC發病相關，但其具體機制尚不明確，本研究中在吸煙、EBV暴露因素下，IL-8-251位點SNPs與吸煙、EBV感染因素對NPC易感性存在負交互作用，可見，IL-8基因多態性(-251 T/A 基因型)和表達升高可用來預測NPC疾病復發、遠處轉移的風險，可作為評估NPC治療效果的一個特異性生物學指標。

綜上所述，IL-8-251基因位點TT基因型和TA基因型患NPC的風險顯著升高，AA基因型患NPC的風險顯著降低，且鼻咽癌患者IL-8表達水平明顯升高，對NPC易感性具有診斷價值，IL-8-251位點SNPs與吸煙、EBV感染因素對NPC易感性存在負交互作用。因此，IL-8基因型多態性及表達水平可用于NPC發病風險評估和早期診斷，可作為免疫治療一個有效靶點，在臨床上具有應用推廣價值。