子宮內膜息肉中miR-210和HIF-1α的表達及意義

凌 玲， 徐桂琴， 倪 娜

(南京醫科大學附屬江寧醫院婦產科， 江蘇 南京 211100)

子宮內膜息肉(Endometrial polyps，EP)是臨床常見的由局部子宮內膜過度增生引起的婦科疾病，以子宮腹痛、異常出血、不孕為臨床表現，給女性帶來極大心理負擔并威脅身體健康[1]。目前，多數專家認為EP進程與機體細胞因子、雌激素受體(Estrogen receptor，ER)及孕激素受體(Progesterone receptor，PR)表達異常密切相關[2]。微小RNA-210(miRNA-210，miR-210)是一種缺氧特異性miRNA，miR-210-3p是miR-210成員之一，在子宮內膜異位癥中呈高表達，其有可能是治療子宮內膜異位癥的潛在靶標[3]。缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在子宮內膜異位癥中呈高表達，參與子宮內膜異位癥的發生與發展[4]。子宮內膜息肉與子宮內膜異位癥類似，是與血管新生密切相關的激素依賴性疾病[5]，但miR-210、HIF-1α在子宮內膜息肉中的研究尚未報道。因此，本研究擬通過觀察子宮內膜息肉中miR-210、HIF-1α表達水平，并分析miR-210、HIF-1α的關系及與ER、PR、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的相關性，以期為EP患者早期診治提供生物學指標。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取2018年6月至2019年5月本院經宮腔鏡確診且接受切除子宮內膜息肉的62例子宮內膜息肉患者為息肉組，年齡29～46歲，平均年齡(36.56±6.22)歲；并以同時間段內因不孕癥或子宮畸形進行宮腔鏡檢查并排除EP的正常子宮內膜患者62例為正常內膜組，年齡30～44歲，平均年齡(35.98±6.05)歲。兩組年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本項研究經本院倫理委員會審核、批準后進行實施。診斷標準：EP患者均符合相關診斷標準[6]。納入標準：①符合EP診斷標準；②病理資料完全者；③所有受試者簽署知情同意書。排除標準：①患有子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、子宮腺肌癥、子宮內膜結核、子宮內膜癌者；②近三個月內服用過激素藥物者；③合并自身免疫性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤者；④合并心、肝、肺、腎等重要器官功能障礙者；⑤子宮內曾置入節育器者；⑥近期行宮頸操作者。

1.2主要試劑:人催乳素(Prolactin，PRL)酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購買于上海紀寧實業有限公司；雌二醇(Estradiol，E2)ELISA試劑盒購買于上海晶抗生物工程有限公司；睪酮(Testosterone，T)ELISA試劑盒、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)ELISA試劑盒、孕酮(Progesterone，P)ELISA試劑盒均購買于武漢默沙克生物科技有限公司；TRIzol TM分離試劑、Taq Man Micro RNA reverse transcription kit、Taqman Universal master mix、Taq Man MicroRNA Assay檢測試劑均購買于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3方 法

1.3.1樣品采集及預處理:①所有受試者清晨空腹抽血5mL(月經周期正常者在月經3～5d抽血，月經周期紊亂者在宮腔鏡術前抽血)，置于10mL EP管中，4000r/min離心12min，分離上層血清，于-20℃冰箱中保存，待檢。②EP患者行宮腔鏡檢查時取息肉組織，對照組取子宮內膜組織。將所有組織標本用生理鹽水迅速清洗，分成兩份，一份立即置于液氮罐中，之后保存于-80℃冰箱中；另一份用福爾馬林固定進行病理檢查(經病理診斷確定正常增生期內膜或子宮內膜息肉)。

1.3.2采用ELISA法檢測血清五項性激素:采用ELISA法檢測所有受試者血清PRL、E2、T、FSH、P五項性激素水平，所有操作嚴格依照試劑說明書實施。

1.3.3qRT-PCR法檢測各組織中miR-210、HIF-1α、ER、PR、VEGF表達水平:取出凍存于-80℃冰箱中的組織樣本200mg，于冰上研缽內研磨，加1mL TRIzol TM試劑，依照TRIzol試劑說明書提取組織總RNA，將提取的RNA依照Taq Man Micro RNA reverse transcription kit說明書將其反轉錄成cDNA，之后以1μL cDNA模板，按照Taqman Universal master mix、Taq Man MicroRNA Assay說明書進行擴增、PCR檢測。各檢測目標及內參引物序列見表1。反應體系：2×Master mix 10 μL、cDNA 1μL、PCR forward primer 0.6μL、PCR reverse primer 0.6μL、20×SYBRI 1 μL、加無RNase H2O至總體積為20 μL。反應條件設置：97℃預熱5min，95℃變性45s，63℃退火45s，40個循環。miR-210以U6為內參，HIF-1α、ER、PR、VEGF均以β-actin為內參。以2-△△CT法計算miR-210、HIF-1α、ER、PR、VEGF相對表達水平,見表1。

表1 miR-210 HIF-1α ER PR VEGF及內參U6 β-actin的引物序列

2 結 果

2.1兩組患者血清中五項激素水平比較:兩組受試者血清中PRL、E2、T、P、FSH水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組五項激素水平比較

2.2兩組患者組織中miR-210、HIF-1α、ER、VEGF表達水平比較:與正常內膜組相比，息肉組患者組織中miR-210、HIF-1α、ER、VEGF表達水平均明顯升高(P<0.05)，PR表達水平降低(P<0.05)，見表3。

2.3EP患者息肉組織中miR-210、HIF-1α與ER、PR、VEGF的相關性:經Pearson相關性分析顯示，EP患者息肉組織中miR-210表達水平與VEGF呈正相關(P<0.05)；HIF-1α表達水平與ER、VEGF表達水平呈正相關(P<0.05)，與PR表達水平呈負相關(P<0.05)，見表4。

表3 兩組miR-210 HIF-1α ER PR VEGF表達水平比較

表4 EP患者息肉組織中miR-210 HIF-1α與ER PR VEGF的相關性

2.4EP患者息肉組織中miR-210與HIF-1α的相關性:Pearson相關性分析顯示，EP患者息肉組織中miR-210表達水平與HIF-1α呈正相關(r=0.518，P<0.05)。詳見圖1。

圖1 EP患者息肉組織中miR-210與HIF-1α的相關性

3 討 論

EP是一種婦科常見的子宮內膜疾病，可引起子宮異常出血、不孕等臨床癥狀，具有雌激素依賴性，具有發病率、復發率高的特點，有子宮內膜癌癌變傾向，嚴重危害女性健康，并給患者家庭帶來極大經濟負擔和心理壓力[7]。因此，尋找高效確診EP發生的臨床指標，并給予患者合理的治療方案，對改善患者生活質量具有重大意義。

miRNA是機體內一類具有高度保守的單鏈、非編碼小分子RNA，通過堿基互補配對方式與靶基因mRNA的3'端非編碼區結合，從而調控基因、蛋白表達，影響一系列生物學過程[8]。有關研究發現miR-205與子宮內膜癌發生與發展緊密相關[9]；Pateisky等[10]發現miRNA-154-5p可作為子宮內膜異位癥患者的潛在診斷標志物；以上研究表明子宮內膜疾病發生進展與miRNA表達失調有關。miR-210是一種具有較高穩定性及功能多樣性的缺氧特異性miRNA，可影響血管新生。本研究顯示，子宮內膜息肉組織中miR-210水平顯著高于正常子宮內膜組織，與miR-210在子宮內膜異位癥中表達趨勢一致，提示miR-210可能參與EP的形成與發展。多數學者認為，子宮內膜組織長時間遭受雌激素刺激，孕激素不足與EP發生有關；此外，VEGF可促使纖維組織伴厚壁血管形成，參與EP發生與發展，EP患者子宮內膜息肉組織ER、VEGF表達上調，PR下調[11]，提示EP的發生與ER、PR、VEGF的失調相關。本研究顯示，子宮內膜息肉組織中ER、VEGF呈高表達，PR呈低表達，與上述研究類似。進一步研究分析發現miR-210表達水平與VEGF表達水平呈正相關，提示miR-210可能與VEGF相互作用共同調控EP的發生。

HIF-1α是機體應答缺氧環境的關鍵因子，可通過調控新血管生成、雌激素產生、炎癥因子等相關基因，參與子宮內膜異位癥的發生與發展[12]。王淑貞等[13]研究發現HIF-1α、VEGF在子宮內膜癌中表達上調，且與VEGF存在一定相關性。以上研究提示HIF-1α在子宮內膜病變中發揮一定作用。本研究結果顯示，EP患者子宮內膜息肉組織中HIF-1α表達水平上調，與上述研究趨勢相符，提示HIF-1α對EP發生起到重要作用。有關研究顯示，HIF-1α表達異常與ER、PR、VEGF存在一定聯系[13,14]。本研究顯示HIF-1α表達水平與ER、VEGF表達水平呈正相關，與PR表達水平呈負相關，提示HIF-1α與ER、PR、VEGF相互影響一起參與EP發生與發展進程。進一步研究發現，miR-210與HIF-1α呈正相關，提示miR-210、HIF-1α相互作用，共同參與EP的形成與發展。

綜上所述，miR-210、HIF-1α在EP形成中均表達上調，且兩者呈正相關，兩者對EP形成具有一定評估價值。但本研究樣本量較少，結果可能存在一定偏倚，后續將擴大樣本量進一步研究。