TBX_(20)基因多態性和新生兒先天性心臟病的關系分析

馬立顯

(延安大學咸陽醫院兒童保健科, 陜西 咸陽 712000)

先天性心臟病在臨床較為常見，屬于一種胎兒先天性畸形，活產兒達到了0.4%～5.0%的發生率[1]。近年來，在我國，新生兒出生缺陷率日益提升，因此，為了對先天性心臟病進行及時預防、診斷與治療，臨床很有必要盡可能快地從分子水平將先天性心臟病的發病機制闡明。遺傳因素、環境因素等很多因素均會引發出生缺陷[2]。研究結果顯示[3]，兒童先天性心臟病的發生受到TBX_20基因錯義突變的影響。但是，臨床需要澄清中國先天性心臟病患兒等人群中TBX_20的作用。在對某種疾病的遺傳傾向進行探索與鑒定的過程中，單核苷酸多態性(SNP)評估是臨床通常采用的方法，通過研究易感基因的SNP，能夠將該基因和疾病的相關性明確下來，從而有效診斷、治療疾病并改善疾病預后。本研究分析了TBX_(20)基因多態性和新生兒先天性心臟病的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：隨機選取2016年8月至2018年8月新生兒先天性心臟病患兒40例，其中男性20例，女性20例，日齡5～19d，平均(12.9±2.2)d。在疾病類型方面，4例為法洛四聯癥，21例為室間隔和房間隔缺損，4例為室間隔和房間隔缺損伴動脈導管未閉，3例為動脈導管未閉，3例為室間隔缺損伴動脈導管未閉，3例為房間隔缺損伴動脈導管未閉，2例為室間隔缺損。將這些患者作為研究組，另選取我院同期接生的健康兒童40例作為對照組，其中男性20例，女性20例，日齡6～19d，平均(13.5±2.6)d。兩組兒童的一般資料比較差異均不顯著(P>0.05)。

1.2納入和排除標準:研究組納入標準：①均符合先天性心臟病的診斷標準；②均經體格檢查、四維超聲、超聲心動圖檢查等確診為先天性心臟病；③家長均知情同意。排除標準：①缺乏完整的臨床資料；②合并其他嚴重疾病；③無法有效配合研究。對照組納入及排除標準：出生5min Apgar評分為8～10分，心、肝、腎等臟器功能均正常，且家屬對本研究內容知情，配合本研究。排除家屬不同意對患兒進行TBX_(20)基因多態性研究，或患兒合并重要臟器功能異常。

1.3方 法

1.3.1TBX_20基因SNP預測與分析:預測與分析TBX_20 SNP時應用美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫，將TBX_20、Homo sapiens等關鍵詞輸入NCBI網站的dbSNP數據庫，共將471個和人類TBX_20相關的SNP尋找了出來，有17個SNP存在于人類TBX_20上。

1.3.2采集血氧與基因組DNA提取:將抗凝劑設定為檸檬酸鈉，將兩組兒童的5mL靜脈血抽取出來，對基因組DNA進行提取，在此過程中應用血液基因組DNA提取試劑盒。

1.3.3PCR:將TBX_20第5外顯子基因特異性序列的一對引物設計出來，北京三丸源生物技術公司合成引物，下游引物為5'-GCCCTGAAACTCAATAGCTC-3'，上游引物為5'-CCTCACTGTAATTTGGCCTG-3'。PCR混合物包含2mL基因組DNA(用作模板)+3.0mL 2.5mmoL每種dNTP混合物+1.0mL Taq DNA聚合酶+2.5mL 25mmoL/L MgCl2+3.0mL 10×PCR緩沖液+1.0mL 12mmoL/L引物1+1.0mL 12mmoL/L 引物2+15mL H2O。PCR條件為96℃、96℃、55℃分別6min、27s、54s，28個循環；73℃、75℃分別28s、4min。

1.3.4瓊脂糖凝膠檢測PCR產物:在1%瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行觀察，在瓊脂糖凝膠中加入10μL PCR產物+2mL 6X樣品緩沖液，在52mV下進行18min的電泳。電泳完成后拍攝照片并保存，在此過程中將凝膠成像系統充分利用起來。對PCR結果進行初步檢測。

1.3.5PCR產物序列:三輪聯酶生物技術公司對PCR產物進行測序，比較并分析測序結果，從而對TBX_20基因組序列與PCR擴增產物進行進一步驗證。

1.4統計學分析:采用SPSS21.0對數據進行統計學處理，計數資料采用構成比表示，行χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳:兩組兒童的260/280值在血液基因組DNA濃度=226～360ng/mL時均約1.8，說明提取的基因組DNA具有較好的質量，可以在PCR擴增中應用。TBX_20第5個外顯子的PCR產物大小為350bp，和設計引物對應的TBX_20基因相同。無非特異性條帶。XbaI、EcoRI消化限制酶后獲取的TBX_20基因片段類似于理論預測。

2.2PCR產物測序結果:正向、反向測序兩組兒童的DNA樣品獲取的測序成功率>99%。

2.3測序結果比較:比較從NCBI數據庫獲取的TBX_20基因序列和測序結果，發現二者序列同源性達到99.4%，具有相同的PCR產物。

2.4TBX_20基因的SNP分析結果:為了對群體代表性進行評估，基因分型TBX_20基因的PCR產物，同時進行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗，發現TBX_20基因有SNP位點存在rs3999950：c.774T>C(Ala265Ala)，TBX_20SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符。

2.5TBX_20基因的SNP等位基因頻率與基因型頻率:為了對群體代表性進行評估，對PCR產物進行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗，TBX_20 SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符。研究組患兒的rs3999950位點TT、TC基因型頻率分別為35.0%(14/40)、65.0%(26/40)，對照組患兒的rs3999950位點TT、TC基因型頻率分別為80.0%(32/40)、20.0%(8/40)。研究組患兒的rs3999950位點TC基因型頻率顯著高于對照組(P<0.05)，且兩組兒童C基因位點差異也有統計學意義(P<0.05)。TC基因型OR>1，提升了先天性心臟病發病率。具體見表1。

表1 兩組兒童rs3999950位點基因分布情況及等位基因占比比較n(%)

注：比較兩組C基因位點、T基因位點時，以研究組80個基因位點、對照組80個基因位點進行分析

3 討 論

現階段，rs3999941、rs6950175是臨床已知的TBX_20 SNP位點。相關醫學學者通過嚴格控制與雙盲試驗[4]，發現兒童先天性心臟病和TBX_20多態性rs3999950具有極為密切的關系，因此認為在兒童先天性心臟病的遺傳易感性相關因素中，TBX_20多態性rs3999950占有重要地位。相關醫學研究表明[5]，新生兒先天性心臟病患兒的rs3888850位點TC基因型頻率顯著高于健康兒童，TC基因的優勢比OR>1，C位點頻率等于rs3999950位點，說明先天性心臟病發生率會在TC基因型的作用下提升。相關醫學研究表明[6]，兒童先天性心臟病的發生發展受到TBX_20基因多態性直接而深刻的影響。相關醫學研究表明[7]，先天性心臟病和TBX_20多態性rs3999950具有極為密切的關系，對二者的關系進行探討能夠將有效依據提供給臨床早期發現、治療先天性心臟病的工作，從而促進患兒生活質量的有效提升。

本研究為了分析TBX_(20)基因多態性和新生兒先天性心臟病的關系，隨機選取2016年8月至2018年8月新生兒先天性心臟病患兒40例，將這些患者作為研究組，另選取同期我院來自同一家庭的健康兒童40例作為對照組，統計分析兩組兒童rs3999950位點基因分布情況，結果表明，兩組兒童的260/280值在血液基因組DNA濃度=226～360ng/mL時均約1.8，說明提取的基因組DNA具有較好的質量，可以在PCR擴增中應用。TBX_20第5個外顯子的PCR產物大小為350bp，和設計引物對應的TBX_20基因相同[8]。無非特異性條帶。XbaI、EcoRI消化限制酶后獲取的TBX_20基因片段類似于理論預測。正向、反向測序兩組兒童的DNA樣品獲取的測序成功率>99%。比較從NCBI數據庫獲取的TBX_20基因序列和測序結果，發現二者序列同源性達到99.4%，具有相同的PCR產物。為了對群體代表性進行評估，基因分型TBX_20基因的PCR產物，同時進行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗，發現TBX_20SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符，TBX_20基因有SNP位點存在rs3999950：c.774T>C(Ala265Ala)。為了對群體代表性進行評估，對PCR產物進行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗，TBX_20 SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符。研究組患兒的rs3999950位點TC基因型頻率顯著高于對照組，且兩組兒童C基因位點差異也有統計學意義。TC基因型OR>1，提升了先天性心臟病發病率，和上述相關醫學研究結果一致，說明在先天性心臟病的遺傳易感性因素中，TBX_20基因多態性占有重要地位。

但是，本研究也有一定的局限性。首先，由于本研究只將40例新生兒先天性心臟病患兒收集了起來，具有較少的病例數；其次，由于具有較小的隊列規模，沒有對不同類型先天性心臟病進行對比，因此，進一步研究應該將不同類型先天性心臟病增加其中，從而將先天性心臟病發生發展和TBX_20多態性的相關性進一步提供出來；最后，本研究沒有進一步依據性別、年齡、種族分類。

總之，TBX_(20)基因的SNP位點rs3999950可能和新生兒先天性心臟病的發生具有密切關系，值得臨床充分重視。