刺梨預防D-半乳糖誘發小鼠皮膚衰老的作用研究

劉思彤，尹日鳳，韋玥吟，夏星，李宇清

（1.廣西中醫藥大學廣西高校中藥藥理重點實驗室，廣西南寧530200；2.廣西中醫藥大學公共衛生與管理學院，廣西南寧530200）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）為薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木繅絲花的果實，主要出產于我國西南地區及陜西、甘肅、江西、福建、湖北、廣西等地，其營養價值高兼有滋補健身之效[1]。果中富含維生素C、多酚、黃酮、有機酸、多糖、氨基酸等成分，現代研究認為刺梨中富含抗氧化活性成分[2-5]，具有較好的調節機體免疫力和延緩衰老的作用[6]。我國傳統醫學認為“生長壯老已”是機體生理變化的5 個階段，《素問上古天真論》道：“女子五七，陽明脈衰，六七，面皆焦，發始白。丈夫六八，陽氣衰竭于上，面焦，發鬢頒白。”指出人體衰老的最明顯外觀表現即為皮膚干燥、松弛、皺紋增多等皮膚老化的狀態。《靈樞天年》有“七十歲，脾氣虛，皮膚枯”的描述，表明皮膚衰老的本質與脾臟直接相關。《中華本草》記載，刺梨歸脾、腎、胃經，有滋補強壯的功效，可見刺梨可能通過補益脾臟減輕皮枯面焦[7]。現代醫學認為，引起皮膚老化的關鍵原因是各種因素導致的真皮層和表皮層的氧化應激，因此有強大抗氧化功效的刺梨可能對皮膚衰老進程產生影響。目前關于食用刺梨影響皮膚衰老的作用研究并不多，本文從中西醫學的認識出發，在皮下注射D-半乳糖引起皮膚衰老動物[8]中考察了刺梨的影響，科學評價刺梨的抗皮膚衰老作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受試動物

昆明種健康小鼠：SPF 級，雌雄各半，體重18 g～22 g，廣西醫科大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SCXK 桂 2014-0002）。

1.1.2 材料與試劑

刺梨全果提取物：桂林實力科技有限公司，為刺梨全果浸提物經干燥后所得產品，其中刺梨總酚含量≥8%，多糖含量≥7%，維生素C 含量≥3%。

D-半乳糖：北京索萊寶生物科技有限公司；丙二醛（malondiadehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidx dismutase，SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、總蛋白檢測試劑盒及羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）：南京建成生物工程研究所；透明質酸（hyaluronic acid，HA）ELISA 檢測試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設備

DT-100 型電子天平：美國雙杰兄弟（集團）有限公司；UV1901 型分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SK-Ⅲ皮膚水分測定儀：深圳市菲斯凱爾電子廠；DM2500 顯微鏡：德國 Leica 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及皮膚衰老造模

將小鼠隨機分為6 組，每組14 只，分別為正常對照組，模型組，維生素E（0.1 g/kg）陽性對照組，刺梨高劑量組（2 g/kg）、中劑量組（1 g/kg）、低劑量組（0.5 g/kg）。正常對照組皮下注射生理鹽水，其余各組小鼠每天1次皮下注射D-半乳糖（1 g/kg），連續6 周，建立亞急性皮膚衰老小鼠模型。在注射D-半乳糖的同時，各組動物灌胃服食相應樣品，每天1 次，連續6 周，對照組與模型組灌胃等量的蒸餾水。

1.2.2 皮膚水分測定

實驗期間每7 d 采用皮膚水分測試儀測定皮膚水含量1 次，記錄皮膚含水百分比。

1.2.3 皮膚及血清抗氧化指標測定

末次灌胃后1 h 處死動物，取血離心分離血清，依照試劑盒方法測定血清MDA、SOD 及T-AOC。

1.2.4 皮膚及血清抗氧化指標測定

小鼠背部皮膚除去皮下脂肪和其他結締組織，稱質量，取9 倍質量的預冷生理鹽水制備皮膚勻漿，勻漿液在 4 ℃、3 000 r/min 離心 10 min，取上清液，分別按照試劑盒說明檢測皮膚組織中HYP、HA、MDA、SOD及皮膚總蛋白含量。

1.2.5 皮膚組織結構觀察

末次給藥后1 h 處死動物，剪取肩頸部皮膚放入4%中性多聚甲醛溶液固定，HE 染色后進行皮膚形態的組織學觀察。

1.3 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 刺梨對衰老皮膚水分的影響

刺梨對衰老皮膚組織含水量的影響見表1。

造模第一、二周皮膚含水量無明顯變化，從第三周起，模型組皮膚含水量逐漸降低。與模型組比，給藥組皮膚含水量逐漸升高，至第五周，刺梨高劑量組皮膚含水量顯著升高（P＜0.01），且中劑量組升高更為顯著（P＜0.001）。至第六周，高劑量組與中劑量組皮膚含水量顯著高于模型組（P＜0.05）。表明刺梨能顯著改善長期注射D-半乳糖造成的衰老性皮膚水含量下降。

2.2 刺梨對皮膚組織中SOD活力、MDA含量的影響

刺梨對衰老皮膚組織中SOD 活力、MDA 含量的影響見表2。

表1 刺梨對衰老皮膚組織含水量的影響（，n=14）Table 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt on moisture content in aging skin tissues

表1 刺梨對衰老皮膚組織含水量的影響（，n=14）Table 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt on moisture content in aging skin tissues

注：與模型組比較，* 表示差異顯著，P＜0.05；** 表示差異極顯著，P＜0.01。

組別劑量/（g/kg）第一周/%第二周/%第三周/%第四周/%第五周/%第六周/%正常 21.86±2.97 23.77±6.55 23.44±3.97 22.45±2.85 22.58±2.36 21.19±2.66模型 22.78±2.11 21.55±2.86 23.16±3.70 21.89±3.49 21.61±2.55 20.99±2.68陽性 0.1 25.76±6.38 22.88±3.23 21.52±4.68 23.28±3.05 23.94±2.61* 23.82±3.20*刺梨高劑量 2 23.08±2.78 23.49±3.67 22.88±2.47 22.96±2.35 25.14±3.42** 23.53±3.05*刺梨中劑量 1 24.23±4.91 22.53±3.81 21.79±1.78 22.12±2.73 25.73±2.57** 24.04±3.73*刺梨低劑量 0.5 22.17±2.05 22.74±4.71 21.08±1.90 24.61±6.70 23.49±3.54 22.80±3.41

表2 刺梨對衰老皮膚組織中SOD 活力、MDA 含量的影響（，n=14）Table 2 Effects of Rosa roxburghii Tratt on SOD activity and MDA content in aging skin tissues

表2 刺梨對衰老皮膚組織中SOD 活力、MDA 含量的影響（，n=14）Table 2 Effects of Rosa roxburghii Tratt on SOD activity and MDA content in aging skin tissues

注：與正常組比較，#表示差異顯著，P＜0.05；與模型組比較，**表示差異極顯著，P＜0.01。

MDA/（nmol/mg protein）正常 95.45±29.14 1.39±1.78模型 72.68±20.20# 3.47±2.78#陽性 0.1 79.09±19.05 2.20±5.96刺梨高劑量 2 80.33±18.00 1.21±0.38**刺梨中劑量 1 130.54±64.95** 1.15±0.44**刺梨低劑量 0.5 141.15±53.76** 3.06±3.40組別劑量/（g/kg）SOD/（U/mg protein）

與正常對照組相比，模型組皮膚SOD 活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比，刺梨中劑量與低劑量組的SOD 活力顯著升高（P＜0.01）；高劑量與中劑量組的MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。這些結果表明刺梨能顯著改善D-半乳糖造成的皮膚氧化應激損傷。

2.3 刺梨對皮膚組織中HA、HYP含量的影響

刺梨對衰老皮膚組織中HA、HYP 含量的影響見表3。

表3 刺梨對衰老皮膚組織中HA、HYP 含量的影響（，n=14）Table 3 Effect of Rosa roxburghii Tratt on the content of HA and Hyp in aging skin tissues

表3 刺梨對衰老皮膚組織中HA、HYP 含量的影響（，n=14）Table 3 Effect of Rosa roxburghii Tratt on the content of HA and Hyp in aging skin tissues

注：與正常組比較，#表示差異顯著，P＜0.05；與模型組比較，*表示差異顯著，P＜0.05。

HYP 含量/（μg/mg protein）正常 175.8±42.0 2.26±0.69模型 115.0±32.3# 1.71±0.22#陽性 0.1 114.7±34.7 1.86±0.22刺梨高劑量 2 151.8±52.3* 1.85±0.34刺梨中劑量 1 153.2±34.9* 1.77±0.22刺梨低劑量 0.5 127.6±25.1 1.78±0.23組別劑量/（g/kg）HA 含量/（ng/mg protein）

較正常對照組，衰老皮膚中HA 含量顯著減少（P＜0.05），HYP 含量也顯著降低（P＜0.001）；連續服用刺梨高劑量及中劑量后，小鼠皮膚中HA 含量均較模型動物顯著增加（P＜0.05）；刺梨組HYP 含量有升高趨勢。表明刺梨可能通過增加天然保濕因子HA 的含量，緩解D-半乳糖誘發的皮膚衰老。

2.4 刺梨對血清SOD活力、MDA含量及T-AOC的影響

刺梨對衰老動物血清中SOD 活力、MDA 含量及T-AOC 的影響見表4。

表4 刺梨對衰老動物血清中SOD 活力、MDA 含量及T-AOC 的影響（，n=14）Table 4 Effects of Rosa roxburghii Tratt on serum SOD activity，MDA content and T-AOC in aging mice

表4 刺梨對衰老動物血清中SOD 活力、MDA 含量及T-AOC 的影響（，n=14）Table 4 Effects of Rosa roxburghii Tratt on serum SOD activity，MDA content and T-AOC in aging mice

注：與正常組比較，#表示差異顯著，P＜0.05；##表示差異極顯著，P＜0.01；與模型組比較，*表示差異顯著，P＜0.05；**表示差異極顯著，P＜0.01。

T-AOC/（U/mL）正常 139.29±14.98 3.47±0.67 12.34±1.26模型 103.43±24.20## 7.41±2.31## 9.17±1.72##陽性 0.1 98.95±27.27 4.24±2.88 12.93±1.64**刺梨高劑量 2 128.88±24.58# 6.03±1.62* 18.23±2.19**刺梨中劑量 1 107.70±20.93 5.80±1.48* 21.66±1.51**刺梨低劑量 0.5 104.48±17.81 8.91±2.23 21.66±2.53**組別 劑量/（g/kg）SOD/（U/mL）MDA/（nmol/mL）

與正常對照組相比，模型組血清中SOD 的活力顯著降低（P＜0.001），T-AOC 顯著下降（P＜0.001），MDA積累量顯著增加（P＜0.001）。刺梨高劑量能顯著升高血清SOD 活力和 MDA 含量（P＜0.05），并且 3 個劑量的刺梨均能顯著增強血清T-AOC（P＜0.001）。這些結果表明刺梨能改善D-半乳糖造成血液中的氧化應激損傷。

2.5 刺梨對小鼠皮膚組織結構的影響

刺梨對皮膚老化小鼠皮膚厚度及毛囊數的影響見表5，刺梨對小鼠皮膚組織結構的影響HE 染色圖見圖1。

表5 刺梨對皮膚老化小鼠皮膚厚度及毛囊數的影響（，n=14）Table 5 Effects of Rosa roxburghii Tratt on skin thickness and hair follicles in aging mice

表5 刺梨對皮膚老化小鼠皮膚厚度及毛囊數的影響（，n=14）Table 5 Effects of Rosa roxburghii Tratt on skin thickness and hair follicles in aging mice

注：與正常組比較，#表示差異顯著，P＜0.05；與模型組比較，*表示差異顯著，P＜0.05。

組別 表皮厚度/μm 真皮厚度/μm 皮膚總厚度/μm 毛囊數/個正常 18.26±3.97 330.16±171.55 349.42±170.45 20.27±10.73模型 21.02±3.46# 229.32±127.24 287.35±127.77 18.13±13.95陽性 15.68±2.87 219.93±26.01 235.62±26.78 11.20±3.03刺梨高劑量 19.62±3.31 245.46±98.87 265.08±98.51 23.80±12.64刺梨中劑量 18.71±2.33* 249.84±132.17 268.55±131.49 16.38±10.94刺梨低劑量 19.71±3.19 372.70±161.07 392.42±159.39 22.31±8.55

圖1 刺梨對小鼠皮膚組織結構的影響HE 染色圖Fig.1 HE staining of the effect of Rosa roxburghii Tratt on skin structure in aging mice

HE 染色結果顯示，正常對照組小鼠皮膚各層結構完整，皮下毛囊、皮脂腺飽滿，表皮規則，表皮與真皮界線清晰。模型組表皮不規則，基膜界線不明顯，真皮皺縮變薄，皮膚附屬器均有不同程度的減少。刺梨低劑量組皮膚略增厚，皮膚結構完好，可見較多毛囊、皮脂腺。中劑量組皮膚組織未見明顯改善。刺梨高劑量組皮膚附屬器明顯增加。

3 結論

現代醫學對于皮膚衰老主要采用防曬、抗氧化劑、維甲酸類、雌激素類以及局部消除皺紋等方法作為防治手段[9-10]，但這些防治措施并不能真正地延緩皮膚衰老。在日常飲食中增加富含抗氧化成分的天然果蔬[11]，以延緩皮膚衰老的防治方法越來越受人們的關注。

衰老過程分為自然衰老和光老化，氧化損傷是皮膚衰老的重要因素。在機體自然衰老的過程中，氧自由基清除能力下降，氧自由基不斷累積，機體出現氧化應激，皮膚也會隨之衰老。光老化主要是機體在生活過程中受到紫外線的過度照射，使得皮膚中的氧自由基大量聚集，SOD 等氧化酶清除速度遠不及對因紫外線刺激而產生的氧自由基累積速度，所以紫外線可以使皮膚在短時間發生衰老，可致皮膚細胞衰老或細胞過早死亡甚至癌變[12]。總而言之，自由基的積累是皮膚衰老的重要因素。當機體的自由基增加時，羥脯氨酸（HYP）發生交聯、降解，從而影響膠原蛋白的結構，使之發生斷裂，皮膚的彈性隨之降低，同時變得干燥[13]。而透明質酸（HA）是存在于真皮中的保濕劑，可鎖住肌膚水分，保持皮膚潤澤，延緩皮膚衰老[14]。衰老小鼠服用刺梨后，皮膚水分含量增多，皮膚組織中HA含量顯著增高，皮膚厚度較模型小鼠增厚，皮膚組織HYP 含量也呈上升趨勢，提示刺梨對皮膚的干燥、粗糙等有一定的治療作用。

此外，皮膚總抗氧化能力（T-AOC）作為一種非酶促抗氧化劑，也間接地反映了氧化應激水平，可以衡量機體的抗衰老指數[15]。SOD 是抗氧化體系中最重要的抗氧化酶，能有效對抗超氧自由基引起的氧化損傷[16]，提高SOD 活力可以發揮其抗衰老的作用。此外，ROS 水平的升高會導致脂質過氧化，而生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化會導致MDA 的形成。MDA 作為脂質過氧化的主要標志，其含量的增加表明，隨著老化進程的延長，過氧化損傷程度增加[17-18]。皮膚衰老小鼠經過刺梨提取物治療后，皮膚和血清的MDA 含量顯著降低，T-AOC、SOD 含量顯著增加，提示刺梨具有抗氧化作用。曹晶晶等[19]利用刺梨多糖在正常KM 小鼠的研究中發現刺梨多糖具有良好的抗氧化和抗疲勞作用，與本實驗的結果相似。本課題組在前期的研究也表明刺梨多糖能夠提高小鼠的抗疲勞能力和耐缺氧能力[20]。

總而言之，刺梨對D-半乳糖誘導的衰老模型小鼠能增加皮膚水分含量，有效改善皮膚干燥、松弛、粗糙的情況；同時增加HA、HYP 以及T-AOC 含量，可有效延緩衰老；降低MDA 含量，增加SOD 含量，表明其抗衰老機制可能與通過抑制活性氧ROS 誘導的脂質過氧化作用有關。