黃嘌呤氧化酶多酚抑制劑的篩選及其作用機制

李昕卓，鄭麗麗，艾斌凌，鄭曉燕，楊旸，楊勁松，盛占武，*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南海口570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚?，海南?？?70102；3.?？谑邢憬渡飳W重點實驗室，海南?？?70102）

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）廣泛存在于牛奶、人和動物細胞中，是催化人體內(nèi)次黃嘌呤和黃嘌呤代謝產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶[1]。尿酸是人體中嘌呤化合物的最終代謝產(chǎn)物，體內(nèi)XOD 含量和活性過高會大量產(chǎn)生尿酸，進而引發(fā)高尿酸血癥、痛風和運動功能受損[2]，長期高尿酸血癥還可誘發(fā)高血壓、糖尿病、冠心病、腎衰竭等疾病[3]，如何有效減低體內(nèi)尿酸的形成是目前國內(nèi)外研究的熱點。XOD 含有1330 個氨基酸，2 個黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine-adenine dinucleotide，F(xiàn)AD），2 個鉬原子和 8 個鐵原子，是嘌呤類化合物催化轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[4]。黃嘌呤氧化酶抑制劑可通過抑制體內(nèi)XOD 的活性而減少尿酸生成，是高尿酸血癥和痛風有效的防治藥物[5]。別嘌呤醇作為一種XOD抑制劑，是目前臨床治療高尿酸血癥及動脈粥樣硬化、腎功能異常、糖尿病、高血壓等常見并發(fā)癥最為有效的藥物之一，可直接結(jié)合XOD 的活性位點，與黃嘌呤競爭性抑制XOD 的活性，然而別嘌呤醇已被證實可誘發(fā)多種不良反應(yīng)，主要包括超敏反應(yīng)、發(fā)熱、皮疹、嗜酸性粒細胞增多癥、肝炎和腎功能惡化等[6]。因此，尋找天然、安全性高、毒副作用小的XOD 抑制劑顯得尤為重要。

天然多酚類化合物大多都可以通過抑制黃嘌呤氧化酶和阻止腎臟對尿酸的再吸收來減少尿酸的合成，進而達到緩解痛風癥狀的目的[7]。如Zhang 等[8]發(fā)現(xiàn)槲皮素以混合型方式可抑制由黃嘌呤氧化酶催化的尿酸和超氧自由基（O2-）的產(chǎn)生。Dong 等[9]證實五種食品中常見多酚短葉松素、高良姜素、喬松素、喬松素呋喃葡萄糖苷和光草甘寧對黃嘌呤氧化酶都有顯著的抑制活性。本研究旨在明確槲皮素、白藜蘆醇、EGCG、橙皮苷、鼠尾草酸、山萘酚、高良姜素等天然來源的多酚單體對黃嘌呤氧化酶的抑制效果，對篩選出的高活性單體（白藜蘆醇、EGCG 和橙皮苷）進行熒光猝滅和分子對接模擬實驗，明確這些多酚單體抑制XOD 活性的作用方式、結(jié)合位點及其對XOD 結(jié)構(gòu)的影響并揭示其作用機制，以期為黃嘌呤氧化酶抑制劑的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃嘌呤氧化酶（0.5 U/mg）：美國 Sigma 公司；白藜蘆醇（純度≥99%）：Acros 公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）（純度≥98%）、山奈酚（純度≥98%）、黃嘌呤（純度≥99%）：北京索萊寶科技有限公司；橙皮苷（純度≥95%）、鼠尾草酸（純度≥98%）、高良姜素（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜：江蘇強盛功能化學股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ML204/02 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ALXD 超低TOC 生物型超純水系統(tǒng)：重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司；JP-080B 超聲波清洗機：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；Multiskan GO 全波長酶標儀：美國 Thermo Fisher Scientific 公司；DK-S26 水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海新諾儀器設(shè)備有限公司；F-7000 FL 熒光分光光度計：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚對XOD 活性的抑制效果

參照楊華等[10]的方法并略作修改，測定幾種多酚單體對XOD 活性的抑制能力。將多酚單體樣品用少量二甲基亞砜（最終濃度＜1%）溶解，再用磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L、pH7.4）稀釋至 10、20、50、75、100 μg/mL。在96 微孔板中分別加入50 μL 0.1U/mL 黃嘌呤氧化酶和 100 μL 不同濃度的槲皮素、白藜蘆醇、EGCG、橙皮苷、鼠尾草酸、山萘酚、高良姜素，10 min 后加入50 μL 0.16 mmol/L 黃嘌呤，每個樣品做3 次重復，以磷酸緩沖鹽溶液替代多酚單體作為空白對照組，并根據(jù)以下公式進行計算多酚單體對黃嘌呤氧化酶的抑制率：

式中：OD1為單體、酶和底物混合的吸光值；OD2為PBS 緩沖液、酶和底物混合的吸光值；OD3為單體、PBS 緩沖液和底物混合后的吸光值；OD4為PBS 緩沖液和底物混合后的吸光值。

1.3.2 多酚單體對XOD 抑制動力學分析

XOD 濃度為0.1 U/mL，選取5 種不同濃度的單體并改變黃嘌呤的濃度分別為 0.04、0.08、0.16、0.24、0.32 mmol/L，利用全波長酶標儀的動力學/時間軟件，在波長295 nm 處每隔10 s 測定1 次吸光值，共測300 s[11]。Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖即以底物黃嘌呤濃度的倒數(shù)1/[S]為X 軸，酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)1/v為Y 軸作圖，判斷幾種多酚單體對XOD 的抑制類型，抑制常數(shù)Ki的測定是通過選取兩個僅改變底物濃度的酶活體系，計算不同濃度多酚單體抑制劑存在時酶促反應(yīng)的速率，采用Dixon 作圖法計算出Ki值[12]。

1.3.3 多酚單體與XOD 的分子對接模擬

用Autodock4.2 軟件對3 種多酚單體和XOD 進行了分子對接。受體黃嘌呤氧化酶的pdb 格式文件可從protein data bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中下載（編號：1fiq），并對其進行去水、加氫、計算點電荷等處理使其能量最小化[13]。應(yīng)用拉馬克（Lamarckian GA）遺傳算法來計算蛋白質(zhì)與多酚單體可能的構(gòu)象。在對接過程中，最多考慮了化合物的10 個構(gòu)象，取結(jié)合自由能最低的構(gòu)象用來做進一步的分析[14]。對接結(jié)果使用Ligplot+和Py－MOL 進行結(jié)合位點分析和圖形顯示。

1.3.4 多酚單體與XOD 的熒光猝滅實驗

將含有300 μL 樣品的比色皿分別置于288 K 恒溫箱和298、308 K 水浴鍋中[15]。將0.6 mL 多酚單體與0.3 mL XOD 混合置于比色皿中繼續(xù)靜置水浴10 min后進行熒光掃描。固定激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長從300 nm 到500 nm，激發(fā)、發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度12 000 nm/min。

以下Stern-Volmer 方程的數(shù)據(jù)分析方法如下公式所述[16]：

為研究二者相互作用力的類型，將以上熒光猝滅的實驗數(shù)據(jù)代入修正的Stern-Volmer 方程：

式中：F0為未加猝滅劑時XOD 的熒光強度；F 為加猝滅劑后XOD 的熒光強度；[Q]為猝滅劑的濃度；KSV為Stern－Volmer 動態(tài)猝滅常數(shù)；Kq為熒光猝滅的速率常數(shù)；τ0為生物大分子熒光平均壽命，大約為10－8s[17]；Ka為 Stern－Volmer 修正猝滅常數(shù)；fa猝滅劑對初始熒光可接近百分數(shù)。

以下等式用于計算結(jié)合常數(shù)和結(jié)合時的位點數(shù)：

式中：Kb是多酚單體與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合常數(shù)；n 是多酚單體與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合位點數(shù)；Kb和n 是根據(jù)方程（4）從log[（F0-F）/F]與log[Q]的雙對數(shù)回歸曲線的斜率和截距數(shù)值確定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

圖表繪制采用Origin 8.0 軟件繪制熒光猝滅圖和酶的抑制動力學曲線，并用熒光計算公式的線性擬合。用SPSS 22.0 計算多酚單體對XOD 半數(shù)抑制濃度、標準差并做顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚單體對XOD活性的抑制效果

6 種多酚單體和別嘌呤醇對XOD 都有抑制效果，抑制率隨多酚單體和別嘌呤醇濃度的升高而不斷增加，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系（圖1A）。多酚單體和陽性對照（別嘌呤醇）對XOD 抑制率的回歸分析結(jié)果即半數(shù)抑制濃度（IC50）見圖1B。

圖1 不同濃度下6 種多酚單體及陽性對照別嘌呤醇的抑制率和IC50Fig.1 The inhibition rate and IC50 of six polyphenols and positive control allopurinol at different concentrations

所有單體對XOD 活性均表現(xiàn)有抑制作用，其中EGCG、白藜蘆醇、橙皮苷對黃嘌呤氧化酶的抑制率相對較高，IC50分別為 68.99、59.62、59.27 μg/mL。Jia 等[18]也得到了類似的結(jié)果，計算出白藜蘆醇對黃嘌呤氧化酶抑制率的IC50值為908 μM，證實了白藜蘆醇不僅對超氧化物具有清除活性，而且還可抑制XOD 的活性。Rashidinejad 等[19]的研究雖沒有計算具體的IC50，但是也證實了EGCG 對XOD 的抑制活性較兒茶素強，并揭示EGCG 對XOD 活性的抑制作用主要源于其自身含有較多數(shù)量的羥基，其數(shù)量在兒茶素類化合物對黃嘌呤氧化酶活性的抑制中起著重要作用。本研究結(jié)果也證實了上述結(jié)果，白藜蘆醇、EGCG、橙皮苷與其它多酚相比，含有的羥基數(shù)量相對較多且抑制效果較好。多酚結(jié)構(gòu)中位于C-5 和C-7 的羥基以及碳碳之間的雙鍵對XOD 抑制作用至關(guān)重要[20]，而從EGCG、白藜蘆醇和橙皮苷結(jié)構(gòu)分析也符合這一結(jié)論。由此可見，多酚對XOD 活性抑制作用的大小取決于其苯環(huán)和羥基的結(jié)構(gòu)與數(shù)量。

2.2 多酚對XOD抑制作用的類型分析

多酚對XOD 的抑制動力學分析結(jié)果Lineweaver-Burk 曲線如圖2 所示，其中圖2A 中 1～5 EGCG 濃度為 21.82、43.63、109.08、163.62、218.15 μmol/L；圖2B中 1～5 白藜蘆醇濃度為 43.81、87.62、219.06、328.59、438.12 μmol/L；圖2C 中 1～5 橙皮苷濃度為 16.38、32.76、81.89、122.84、163.78 μmol/L。

圖2 EGCG、白藜蘆醇、橙皮苷對XOD 的抑制類型判定圖Fig.2 The determination type of inhibition of XOD by EGCG，resveratrol，hesperidin

可以看出，EGCG、白藜蘆醇、橙皮苷隨著因變量的增加直線的斜率不斷降低，由此推斷三者對XOD 的抑制作用屬于可逆抑制作用[21]，Lineweaver-Burk 曲線表現(xiàn)出典型的競爭性抑制特征，表明三種單體是XOD的競爭性抑制劑[22]。采用Dixon 作圖法，取兩個不同底物濃度[s]的反應(yīng)體系，以加入的抑制劑濃度[I]對反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V 作圖可求出抑制常數(shù)Ki值（圖3）。

由兩條相交直線求出其交點坐標得到EGCG、白藜蘆醇和橙皮苷對XOD 的抑制常數(shù)Ki分別為10.26、20.34、5.33 μg/mL。

從大理藜蘆（百合科）的根和莖甲醇提取物分離出的白藜蘆醇等5 種多酚，對XOD 活性具有抑制作用，并呈劑量依賴型關(guān)系，其中白藜蘆醇對XOD 的抑制效果與本研究結(jié)果一致，抑制率的IC50值為66.1 μmol/L，對XOD 的抑制類型也為競爭性抑制[23]。Aucamp 等[24]研究了5種兒茶素類化合物和兩種黃酮對XOD 的抑制作用，也發(fā)現(xiàn)EGCG 是XOD 的競爭性抑制劑，與本試驗結(jié)果相同。

圖3 EGCG、白藜蘆醇、橙皮苷對XOD 的抑制常數(shù)判定圖Fig.3 The determination constant of inhibition of XOD by EGCG，resveratrol，hesperidin

2.3 單體與XOD熒光猝滅光譜

XOD 含有3 種發(fā)光基團，分別是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[25]。苯丙氨酸具有非常低的熒光量子產(chǎn)率，如果酪氨酸被離子化或接近氨基，羧基或色氨酸，則酪氨酸的熒光幾乎完全被猝滅，可見XOD 的內(nèi)在熒光實際上完全歸因于色氨酸。因此，XOD 的固有熒光強度的變化主要是小分子物質(zhì)引起XOD 中色氨酸殘基熒光強度的變化所致[26]。XOD 中每個亞基的氨基酸序列包括10 個色氨酸殘基[27]，多酚對XOD 猝滅強度的變化結(jié)果見圖4，其中，圖4A 中1～11 EGCG 濃度分別為 10.19、21.82、43.63、65.45、87.26、109.08、130.89、152.71、174.52、196.34、218.15 μmol/L；圖4B 中 1～11 白藜蘆醇濃度分別為 21.91、43.81、87.63、131.44、175.25、219.07、262.88、306.69、350.51、394.32、438.14 μmol/L；圖4C 中1 ～11 橙 皮 苷 濃 度 分 別 為 8.19、16.38、32.76、49.14、65.51、81.89、98.27、114.65、131.03、147.41、163.78 μmol/L；3 個子圖中12 均為XOD。

圖4 在XOD 中分別加入EGCG、白藜蘆醇、橙皮苷的熒光猝滅圖Fig.4 Fluorescence quenching of EGCG，resveratrol，hesperidin in XOD

隨著多酚濃度的增加，XOD 的熒光強度逐漸降低，最終XOD 的熒光峰完全消失，所以多酚是以類似濃度依賴的方式使XOD 發(fā)生熒光猝滅，且很可能與XOD 的某些氨基酸殘基結(jié)合。隨著多酚濃度的增加，熒光強度和發(fā)射波長呈現(xiàn)出線性關(guān)系，表明熒光猝滅類型是單一的靜態(tài)猝滅或動態(tài)猝滅。動態(tài)和靜態(tài)淬滅可以通過它們對溫度的不同依賴性來區(qū)分。對于靜態(tài)淬滅，淬滅常數(shù)隨溫度升高而降低，而在動態(tài)淬滅則相反[28]。根據(jù)Stern-Volmer 方程作圖（圖5）。計算得出猝滅常數(shù)KSV、猝滅速率常數(shù)Kq、修正猝滅常數(shù)Ka、結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點數(shù)n（表1）。

圖5 不同溫度下EGCG、白藜蘆醇、橙皮苷與XOD 結(jié)合的Stern-Volmer 曲線Fig.5 Stern-Volmer curves of resveratrol，EGCG，and hesperidin combined with XOD at different temperatures

表1 3 種多酚單體在不同溫度下對XOD 的Stern-Volmer 猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)Table 1 Stern-Volmer constant，KSV and biomolecular quenching rate constant，Kq for resveratrol，EGCG，and hesperidin with XOD

當多酚濃度較低時，KSV和Kq值隨著溫度的升高而減小，說明形成的多酚和酶的復合物不穩(wěn)定，XOD的猝滅效果差，Kq值高于各種生物聚合物的最大碰撞淬滅常數(shù)（2.9×1010L/（mol·s））表明了猝滅過程是靜態(tài)的，這可能是由于多酚單體-XOD 復合物的形成導致XOD 的構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變了熒光氨基酸殘基的微環(huán)境，導致了XOD 熒光的靜態(tài)猝滅[29]。KSV與Kb趨勢相反，表明多酚單體可能獨立結(jié)合XOD 的幾個不同位點，包括XOD 中的熒光和非熒光氨基酸殘基[9]。Ka數(shù)值較大，表明多酚和XOD 之間存在較強的相互作用[30]。此外，Ka還隨溫度的升高而降低，說明隨著溫度的升高，多酚與XOD 之間的相互作用減弱。從表1 數(shù)據(jù)可知，n 值在1 附近，說明多酚單體與XOD 結(jié)合有且只有一個結(jié)合位點。3 種多酚單體與XOD 結(jié)合常數(shù)Kb的大小順序為：橙皮苷＞EGCG＞白藜蘆醇，這可能是由于橙皮苷和EGCG 自身含有較多的羥基，容易與氨基酸殘基之間形成氫鍵或靜電作用，表明位于結(jié)合位點周圍的多酚單體與生物活性物質(zhì)之間的結(jié)合能力發(fā)生了一些改變[19]。

2.4 多酚與XOD的結(jié)合位點分析

XOD 是以同型二聚體形式表示的氧化還原酶，包括4 個氧化還原中心，一個FAD 結(jié)構(gòu)域和具有兩個鐵硫中心的N-末端結(jié)構(gòu)域。酶的活性中心通常被認為是結(jié)合位點結(jié)構(gòu)域和在N 末端的2[Fe-S]/鐵硫結(jié)構(gòu)域[31]。當?shù)孜稂S嘌呤在XOD 的Mo-pt 結(jié)構(gòu)域附近經(jīng)歷氧化反應(yīng)時，同時底物氧在FAD 中心處發(fā)生還原并且發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，導致形成超氧陰離子（O2-）或過氧化氫（H2O2）自由基[32]。

為了闡明多酚單體與XOD 的結(jié)合機制，通過AutoDock4.2 對3 種多酚單體與XOD 進行分子對接，得到的最優(yōu)結(jié)果如圖6。

圖6 EGCG、白藜蘆醇、橙皮苷與XOD 的分子對接Fig.6 The docking models of XOD inhibition by EGCG，resveratrol，hesperidin

由圖6 可知，白藜蘆醇作用于XOD 的Mo-pt 結(jié)構(gòu)域活性中心附近，EGCG、橙皮苷作用于XOD 的FAD 結(jié)構(gòu)域上，最優(yōu)構(gòu)象的吉布斯自由能分別為-8.8 kcal/mol，-11.7 kcal/mol，-11.2 kcal/mol，說明白藜蘆醇、EGCG、橙皮苷和XOD 可自發(fā)地反應(yīng)結(jié)合形成復合物。多酚單體與XOD 的二維結(jié)合圖如圖7 所示。

在復合物中橙皮苷與XOD 的關(guān)鍵殘基Lys256，Leu257，Val258，Thr262，Glu263，Ile264，Gly349，Gly350，Ile353，Thr354，Pro400，Ile403 具有疏水相互作用，并且與 Val259，Gly260，Asn261，Glu267，Arg394，Leu398，Gly399，Glu402，Leu404 都形成了氫鍵，這表明氫鍵是多酚單體與XOD 結(jié)合的另一主要作用力[33-34]。EGCG位于 FAD 結(jié)構(gòu)域周圍由 Gly46，Leu74，Glu263，Ile266，Leu305，Phe337，Ala346，Gly350，Asn351，Asp360 氨 基酸殘基包圍的疏水口袋中，與Glu45，Ser347，Thr262，Ile358，Arg426，Lys433 形成氫鍵[35]。白藜蘆醇與鉬喋呤MOS3004 活性中心附近的 Thr1010，Ala1079 形成氫鍵，與氨基酸殘基 Leu648，Phe649，Glu802，Leu873，Ser876，Phe914，Phe1009，Val1011，Leu1014，Ala1078和鉬喋呤Mos1334 活性中心形成疏水相互作用[36]。Leu648，Phe649，Glu802 等殘基被證明在底物黃嘌呤的羥基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表明氫鍵是白藜蘆醇與XOD 結(jié)合的主要作用，表明白藜蘆醇具有與底物相同的結(jié)合區(qū)域[37]。

因此，在多酚單體與XOD 的疏水殘基結(jié)合的過程中，氫鍵與疏水作用在多酚單體-XOD 復合物形成過程中起到了重要作用，是多酚單體與XOD 結(jié)合的主要驅(qū)動力?；趯咏Y(jié)果，可以推斷多酚單體對XOD 活性的抑制作用可能是因為其插入到XOD 的疏水縫隙中占據(jù)了其催化活性中心，與底物黃嘌呤競爭結(jié)合XOD 的活性位點，阻礙了底物的進入，并且多酚的進入誘導了XOD 構(gòu)象的變化，直接導致其活性降低。結(jié)合對單體化學結(jié)構(gòu)的觀察和分子對接模擬實驗結(jié)果的分析，推測白藜蘆醇、EGCG、橙皮苷對XOD 的抑制效果優(yōu)于其他常見的多酚的原因可能是其擁有對XOD 產(chǎn)生高抑制活性的必須結(jié)構(gòu)，如芳香環(huán)的C-5 和C-7 上的羥基[20]，同時它們具有更多的疏水的芳香雜環(huán)或羥基，便于與XOD 的多個殘基形成氫鍵或產(chǎn)生疏水作用。Tang 等[38]發(fā)現(xiàn)丹參酚酸C（salvianolic acid C，SAC）能夠插入XOD 活性腔中，Mo-Pt 結(jié)構(gòu)域的活性位點也位于活性腔中，推斷SAC 可以與底物黃嘌呤競爭結(jié)合XOD 的活性位點，與本試驗EGCG 和橙皮苷的結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

本文研究了6 種常見多酚單體對XOD 的抑制作用，其中白藜蘆醇、EGCG 和橙皮苷的抑制率最高，抑制 XOD 的 IC50分別為 261.22、150.51、97.08 μmol/L。白藜蘆醇、EGCG 和橙皮苷可逆且競爭性抑制XOD 活性，Ki值分別為 10.26、20.34、5.33 μg/mL。由于單體和XOD 的配合物的形成，靜態(tài)猝滅了XOD 的熒光，通過猝滅常數(shù)、猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)的分析，掌握了不同溫度下XOD 猝滅程度的變化規(guī)律。分子對接分析表明多酚單體與XOD 的一些重要氨基酸殘基通過氫鍵和疏水相互作用，與3 種單體親和力較高的位點分別位于FAD 結(jié)構(gòu)域和Mo-pt 結(jié)構(gòu)域活性中心。上述3 種多酚抑制XOD 活性的半數(shù)抑制濃度略高于臨床常用藥別嘌呤醇，但是它們都來源于天然產(chǎn)物，毒副作用小，可以作為輔助降尿酸功能營養(yǎng)食品或藥品中添加的主要成分。