糖基化修飾對澳洲堅果蛋白性質的影響

董璐，吳亞敬，賈增艷，吳玥琨，張燕

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457；2.南開大學醫學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300071）

食物過敏，醫學上稱之為變態反應，是由食物中所包含的某些成分引起的一種人體免疫系統的不良反應，最常見的是由免疫球蛋白E 介導的過敏反應[1]。食物中的過敏原主要來自于蛋類、奶類、谷物類、魚類、堅果類等食物中的蛋白質[2]。徐海濤等[3]通過食物過敏皮膚點刺實驗分析了1 294 名1 歲以下嬰兒因食物過敏導致的皮膚病的過敏原，結果表明易導致過敏主要物質為雞蛋清、花生、雞蛋黃、小麥、大豆中的蛋白質，其次為蝦、魚類和牛奶中的蛋白質。攝入蛋白質可以為人們健康帶來益處，但食物中蛋白質導致的食物過敏食又為人們健康敲響警鐘。

抗原決定簇又稱抗原表位，是決定蛋白質抗原性的特殊化學基團，經多項研究表明，食品加工過程能在很大程度上影響蛋白質的抗原決定簇，從而在一定程度上消除或降低食物過敏原的免疫反應性，降低敏感人群的過敏幾率[4-11]。食品加工可以導致蛋白質結構不同程度的改變，包括聚集，折疊和糖化，以及美拉德反應產物的出現。所有這些改變都可能會影響到過敏原與IgE 結合能力，從而增加或減少蛋白質的變應原性[12]。目前，有很多研究不同加工方式對過敏原的結構，免疫反應性及致敏性的影響，希望能通過加工的方式降低食品中蛋白質的致敏性，開發低致敏食品[13-15]。

澳洲堅果又稱夏威夷果，是一種具有很高營養價值的堅果類食品，備受人們喜愛。有研究表明，澳洲堅果具有提高人體免疫力，增強體質的功能[16]。但是澳洲堅果中的蛋白也會引起較為嚴重的過敏反應，經過加工或者生鮮的澳洲堅果被患者食用后，會使得患者出現全身瘙癢、呼吸困難、嘴唇及眼睛腫脹甚至昏厥的現象，引起不同程度的過敏現象[17]。Sicherer 等[18]對易過敏的188 名參與者進行了調查，其中約有9%對澳洲堅果敏感。

食物過敏已成為世界范圍普遍關注的食品安全問題，如何通過食品加工手段降低食物過敏原的致敏性，開發低致敏食品是食品科學領域重要的研究方向。目前，通過加工處理來改變澳洲堅果蛋白（Macadamia protein，M-Pro）的免疫反應性的研究未見相關報道。本研究通過模擬熱加工條件，研究不同種類的糖對M-Pro 糖基化修飾產物的溶解性，消化性以及免疫反應性的影響，探究降低M-Pro 潛在致敏性的有效手段，為開發低致敏食品奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，標品級）、HRP-羊抗兔酶標二抗、α-糜蛋白酶（40 U/mg）、胰蛋白酶（10 000 BAEE U/mg）、蛋白酶（來自灰色鏈霉菌屬，3.5 U/mg）：美國 Sigma 公司；ProteinA-SepHarose 4B凝膠：美國Amersham 公司；蛋白質分子量預染Marker、澳洲堅果蛋白兔多克隆抗體血清：天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室自制；澳洲堅果：云南江城中澳農業科技發展公司；無水乙酸鈉、β-環糊精、檸檬酸、過氧化氫脲、3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）、二甲基亞砜、三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、甲醇、氯化鈉、吐溫-20 為分析純。

Multiskan Sky 全波長酶標儀：美國Thermo 公司；Mini-PROTEAN Tetra 電泳儀、Mini Trans-Blot 轉印槽、ChemiDoc XRS 凝膠成像系統：美國Bio-Rad 公司；S210-B pH 計：瑞士梅特勒-托利多公司；RH-KT/C 磁力攪拌器、MS-3 搖床：德國IKA 公司；Microfuge 20R冷凍離心機：美國貝克曼公司；PT2500E 勻漿機：美國OMNI 公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 包被緩沖液

碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）：分別稱取 1.60 g 的 Na2CO3，2.91 g 的 NaHCO3，用去離子水定容到1 L。

1.2.2 洗滌緩沖液

PBST（pH7.4）：準確稱取13.76g的Na2HPO4·12H2O，1.79 g 的NaH2PO4·H2O，9 g 的NaCl 用去離子水溶解后加入 0.50 mL 的 Tween-20（20%），定容到 1 L。

1.2.3 底物顯色液

底物液A：準確稱取4.10 g 無水乙酸鈉，1.25 g β-環糊精，1.615 g 檸檬酸，214.3 mg 過氧化氫脲，定容至500 mL。

底物液B：0.2 TMB 溶于20 mL 的二甲基亞砜。

1.2.4 10 倍蛋白電泳緩沖液

稱取Tris 30.3 g，甘氨酸144.2 g，十二烷基硫酸鈉10.0 g，用去離子水定容到1 L。

1.2.5 轉膜緩沖液

10 倍蛋白電泳緩沖液 ∶甲醇 ∶去離子水（1 ∶2 ∶7，體積比）。

1.2.6 20×Tris 緩沖生理鹽水

稱取48.4 g Tris，160.0 g 氯化鈉于去離子水中充分溶解，調pH 值至7.6，定容到1 L。

1.2.7 Tris 緩沖生理鹽水-吐溫緩沖液

取 20×的 TBS 緩沖液 50 mL，稀釋成 1×溶液，加入5 mL 吐溫-20。

1.2.8 消化酶液

稱取 16 mg 胰蛋白酶、39.6 mg α-糜蛋白酶、23 mg蛋白酶，用去離子水使3 種蛋白酶完全溶解，調節pH值到8.0，定容到10 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 M-Pro 的制備

根據實驗室前期優化的M-Pro 提取方法提取MPro[19]。采用 Bicinchoninic Acid 試劑盒測定 M-Pro 含量，試驗步驟按試劑盒說明書進行。測得M-Pro 含量為90.40%。

1.3.2 糖基化修飾M-Pro

根據提取的M-Pro 質含量稱取蛋白質，使M-Pro分別與葡萄糖和蔗糖按照質量比為3 ∶1 和1 ∶1 混勻，稱取各樣品300 mg 于帶螺帽厚壁加熱管中，分別在160 ℃和180 ℃下加熱處理。以未處理的M-Pro 及分別在160 ℃和180 ℃下熱處理的M-Pro 作為對照。

1.3.3 M-Pro 溶解性的測定

將熱處理后的樣品研磨至粉末狀后，稱取200.0 mg溶于 5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 8.5），搖床振蕩混勻3 h，使蛋白充分溶解，之后吸取上清液3 mL 于10 000 Da 的超濾離心管中，5 000 r/min 離心 10 min，將溶液濃縮到250 μL 后用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。以牛血清蛋白為標準品，考馬斯亮蘭G-250 為染料，在595 nm 處測定吸光度值（A595）繪制標準曲線，將待測樣品稀釋20 倍，測定A595，計算樣品濃度。根據稀釋倍數換算蛋白質的溶解率，并以未處理的M-Pro的溶解率作為基準，計算相對溶解率。

1.3.4 澳洲堅果蛋白免疫反應性的測定

試驗所用抗體為實驗室自制兔多克隆抗體，通過ProteinA-SepHarose4B 凝膠純化獲得，濃度為1.5 mg/mL。

采用間接競爭酶聯免疫競爭吸附（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）方法測定試樣的 IC50值。操作步驟如下：（1）用包被液稀釋M-Pro，濃度為 0.25 μg/mL包被在酶標板上，100 μL/孔，在 4 ℃下包被 15 h；（2）包被結束后甩出包被液，用洗滌緩沖液洗板3 次，2 min/次，200 μL/孔加入1%的脫脂乳粉作為封閉液，在37 ℃封閉1 h；（3）封閉結束后甩出封閉液，用Tris 緩沖生理鹽水-吐溫緩沖液重復洗板3 次，2 min/次，空白孔加入 100 μL PBS（0.01 mol/L，pH 8.0）、對照孔加入 50 μL PBS 和 50 μL 抗體，加樣孔加入 50 μL 待測樣品蛋白溶液和50 μL 稀釋20 000 倍的M-Pro 兔多克隆抗體，37 ℃孵育 1 h；（4）孵育結束后甩出溶液，用 Tris 緩沖生理鹽水-吐溫緩沖液重復洗板4 次，2 min/次，將稀釋了25 000 倍的HRP-羊抗兔酶標二抗以100 μL/孔加入到酶標板中，37 ℃孵育30 min；（5）孵育結束后甩出溶液，用Tris 緩沖生理鹽水-吐溫緩沖液重復洗板5 次，2 min/次，底物液 A 與底物液 B 按 33 ∶1（體積比）混合均勻，100 μL/孔，置于 37 ℃顯色 15 min；（6）每孔加入 100 μL 終止液（H2SO4溶液 1.25 mol/L），終止后顯示黃色。（7）讀取各個孔的吸光度值A450～650，按照以下公式計算抑制率：

式中：A對照、A樣品和 A空白分別為對照孔、樣品孔和空白孔的平均吸光度值。

1.3.5 澳洲堅果蛋白消化性的測定

采用pH 值降低法測定待測樣品的消化率[20]。不同條件處理后的M-Pro 樣品研磨致粉末狀后，稱取100 mg，定容到 25 mL。37 ℃水浴 1 h，調 pH 值至 8.0，取1 mL 配置好的消化酶液加入到各樣品中，消化10 min 并伴隨磁力攪拌（50 r/min），之后煮沸 5 min 滅酶活，測定消化10 min 時的pH 值。按照以下公式計算消化率：

1.3.6 澳洲堅果蛋白及其消化產物的免疫印跡分析

首先采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對樣品中蛋白進行分離，濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%，上樣濃度為1 mg/mL，分離膠采用80 V 電壓，濃縮膠采用100 V 電壓。SDSPAGE 完成后將凝膠取下進行轉膜操作，用去離子水浸潤凝膠，平衡15 min 后，將轉印膜、濾紙板和凝膠浸泡在轉印緩沖液中平衡30 min。設置電壓為25 V，轉印40 min 后，將轉印膜置于孵育盒中，倒入TBST 緩沖液，置于搖床上24 ℃洗膜5 min。加入15 mL 封閉液在搖床上24 ℃封閉1 h，，加入15 mL 稀釋的兔多克隆抗體，結合1 h。用TBST 洗膜3 次，與稀釋后的HRP-羊抗兔酶標二抗24 ℃結合1 h。然后將AB 曝光液1 ∶1（體積比）在暗室混合后平鋪在轉印膜上，用曝光儀曝光拍照得到抗原抗體結合圖。

1.4 數據處理

所有試驗平行測定3 次，利用統計學軟件SPSS 24.0 對試驗結果進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 糖基化修飾對M-Pro產物溶解性的影響

熱處理條件下，糖基化修飾對M-Pro 溶解性的影響如表1 所示。

表1 熱處理對糖基化M-Pro 相對溶解率（X±SD，%）的影響Table 1 Effect of heat treatment on relative solubility（X±SD，%）of the glycated Macadamia protein

以未經處理的M-Pro 溶解率作為對照，未經糖基化的M-Pro 分別在160 ℃和180 ℃加熱后，相對于未經處理的M-Pro 溶解率分別為10.00%和4.48%，溫度與溶解率呈負相關關系，相較于未處理的M-Pro 溶解性顯著降低（P＜0.05），說明熱處理可以降低蛋白質的溶解性，這可能是由熱處理導致的蛋白質結構改變，蛋白質發生聚集所引起的。而在相同溫度分別被蔗糖和葡萄糖糖基化修飾的M-Pro 的溶解率高于被單獨熱處理的M-Pro 的溶解率，說明蛋白的糖基化修飾有利于在熱處理條件下保持蛋白質的溶解性。有研究結果指出，經過糖基化反應的蛋白質熱穩定較強[21]，且溶解性提高[22]。在相同條件下，葡萄糖作為糖基供體時熱處理得到的糖基化產物的相對溶解率比蔗糖高，可能是由于葡萄糖為還原糖，具有游離醛基，可以迅速與蛋白的氨基進行反應[23-25]，從而提高蛋白質溶解性。

2.2 糖基化修飾對M-Pro免疫反應性的影響

圖1 為以不同濃度未處理的M-Pro 繪制的M-Pro間接競爭 ELISA 標準曲線，IC50為（3.04±0.03）ng/mL。同樣繪制不同處理的M-Pro 間接競爭ELISA 標準曲線，得到相應的IC50（R2＞0.99）。表2 為不同處理條件M-Pro 的 IC50。

圖1 M-Pro 間接競爭ELISA 標準曲線Fig.1 The standard curve of indirect competition ELISA for Macadamia nut allergens

表2 不同處理方法M-Pro 的IC50（X±SD，μg/mL）的影響Table 2 Effects of different dreatments on the IC50（X±SD，μg/mL）of Macadamia protein

未處理的M-Pro IC503.04±0.03a，未經糖化處理的M-Pro 為分別在 160 ℃和 180 ℃熱處理時，其 IC50分別為9.64 ng/mL 和150.30 ng/mL，IC50顯著增大，說明熱處理可降低M-Pro 的免疫反應性，這可能是由于熱處理能使過敏原蛋白的結構發生變化，導致其與抗體結合的表位或抗原決定簇被隱藏或被破壞，從而與抗體結合的程度降低。在相同溫度下，經葡萄糖和蔗糖糖基化修飾的M-Pro 的IC50顯著大于單獨熱處理的MProIC50，說明糖基化修飾可降低M-Pro 質的免疫反應性，這可能是在糖基化過程中糖與M-Pro 發生化學反應，對蛋白質發生的修飾作用使蛋白的抗原表位破壞或被掩蔽，從而減少了與抗體結合的表位，表現出免疫反應性的降低。有研究結果顯示，當某些蛋白的突變序列的基因被糖基化的糖鏈覆蓋時，能夠避開免疫監視作用同時改變過敏原蛋白的免疫反應性，例如，通過特定的方法把糖鏈接到天門冬酰胺酶上，動物實驗顯示可降低其在小鼠體內的免疫原性[26]。在相同溫度下，葡萄糖糖基化修飾M-Pro 的IC50顯著大于蔗糖糖基化修飾的M-Pro，說明葡萄糖糖基化修飾M-Pro能更好的降低M-Pro 的免疫反應性，分析原因一方面是葡萄糖為還原糖，而蔗糖為非還原糖，還原糖參與糖基化反應速度比非還原糖快且反應程度大；另一方面，葡萄糖屬于六碳單糖，相對于分子量較大的蔗糖而言，葡萄糖內部的C 鏈較短，碳架的空間阻位效應較小，相比之下較容易發生糖基化反應，因此葡萄糖對蛋白的結構修飾作用更大[27]，導致M-Pro 的抗原決定簇的破壞或掩蔽更強，因此蔗糖參與的糖基化反應產物較葡萄糖參與的反應產物的免疫反應性顯著降低（P＜0.05）。朱婷偉[28]在研究糖基化修飾大豆過敏原蛋白的抗原性時發現，用葡萄糖作為糖基供體降低大豆球蛋白的抗原性效果最好。在相同的糖類與加熱溫度條件下，蛋白質與糖的質量比越小，得到的相對IC50值越大，這可能是較高比例的糖的會導致M-Pro 接枝度增加，使得與抗體結合的相應位點減少，與低比例的糖參與糖基化反應比較，得到的糖基化產物的免疫反應性較低，這可能是因為糖的比例越高對蛋白質修飾程度越大，從而更大程度的破壞抗原決定簇。

綜合以上研究結果說明，糖基化反應能降低M-Pro的免疫反應性，且溫度越高，糖與蛋白的比例越高，產物的免疫反應性越小，同時還原糖的影響作用顯著高于非還原糖。

2.3 糖基化修飾的M-Pro的消化率

熱加工對蛋白糖基化產物的消化性，如表3 所示。

表3 熱加工對M-Pro 消化率（X±SD，%）的影響Table 3 Effect of thermal processing on Macadamia protein digestibility（X±SD，%）

與未處理蛋白的消化率95.71%比較，經單獨加熱后M-Pro，消化率降低，說明熱加工能使蛋白改性，且隨著加熱溫度的升高，消化率降低到92.75%，可能是熱加工使蛋白形成了疏水性聚集體從而更耐水解。當堅果蛋白與蔗糖、葡萄糖混合加熱形成糖基化產物的消化率降低到90.35%，消化率降低可能是糖基化修飾了蛋白，減少了消化酶的識別位點[29]。在相同條件下，與蔗糖相比，葡萄糖糖基化修飾的M-Pro 的消化率較低，這可能是由葡萄糖比蔗糖作為糖基供體發生糖基化反應的速率較快，使得蛋白質表面更多的酶水解位點被覆蓋，導致消化率降低。因此，葡萄糖修飾對M-Pro 的修飾作用更強，使得消化率降低。在加熱溫度和糖的種類相同的情況下，糖含量越高，糖基化修飾的M-Pro 消化率越小，這可能是由于糖的含量增加會導致蛋白被糖修飾的程度增大[30]，使澳洲堅果蛋白表面的酶水解位點相對較少，從而降低蛋白的消化率。

綜合以上試驗結果，糖基化能降低澳洲堅果蛋白的消化率，溫度越高消化率越低。

2.4 免疫印跡抗體識別性

2.4.1 糖基化M-Pro 免疫印跡抗體識別性

將熱處理后的可溶性蛋白進行免疫印跡分析，如圖2。

圖2 M-Pro 及不同條件下糖基化產物的免疫印跡結果Fig.2 Western blot results of Macadamia protein and glycosylation products under different conditions

未處理蛋白與特異性抗體結合反應明顯，制備蛋白的所有組分均與對應抗體識別。與未處理蛋白相比，單獨加熱處理的蛋白（160、180 ℃）與抗體結合的條帶沒有變化，但條帶顏色隨著加熱溫度的增高而變淺，說明蛋白組成變化不大。糖基化反應后，產物與抗體的識別能力大大降低，只有在18 kDa 附近的蛋白顯示較弱的抗體結合力。蛋白與蔗糖質量比為3 ∶1 時糖基化產物的免疫印跡條帶較清外，說明糖基化反應顯著降低了蛋白與抗體的識別力，可能是由于抗原表位結構的破壞，導致不能與特異性抗體識別位點的結合。

2.4.2 模擬消化物免疫印跡抗體識別性

模擬消化后蛋白的結構變化，將消化物進行免疫印跡分析，結果如圖3。

圖3 熱加工對M-Pro 糖基化產物模擬消化產物的免疫印跡結果Fig.3 Immunoblot results of macadamia protein glycosylation products simulated by thermal processing

未消化蛋白與所制備的特異性抗體有明顯的結合反應，制備的蛋白所有組分均能與對應抗體識別，而未處理的蛋白經過消化后僅剩3 條蛋白條帶與抗體結合，分別在30、43、50 kDa 左右，這可能是在消化過程中大部分的蛋白被水解成小片段不能識別抗體。蛋白經過160 ℃單獨熱加工時，消化產物僅有17、20 kDa左右的分子量的蛋白與抗體結合，經過180 ℃單獨熱處理后，消化產物在 17、20、30、43、50 kDa 左右的分子量能識別抗體，這可能是經過熱處理后，消化率降低導致能與抗體結合的蛋白質沒有被消化，使之與抗體的識別能力較高。糖基化產物經過消化后，識別抗體的能力減弱，蛋白與葡萄糖質量比為1 ∶1，加熱160 ℃時，糖基化產物的消化物能與抗體結合條帶較模糊。這可能是由于蛋白的抗原表位被糖鏈修飾，導致不能與特異性抗體識別位點結合。免疫印跡結果與消化率結果一致，消化率越低，蛋白被糖基化修飾的程度越高且隨著加熱溫度的升高形成的不可消化的高聚物越多。

3 結論

糖基化修飾M-Pro 可降低其溶解性、消化性和免疫反應性。與單獨熱處理M-Pro 相比，糖基化修飾降低了M-Pro 的免疫反應性，但提高了M-Pro 的溶解性，且對消化性影響不大。在相同處理條件下葡萄糖參與的糖基化反應比蔗糖對M-Pro 結構的影響程度更大，說明還原糖對改善M-Pro 致敏性更為有效。糖基化處理能顯著降低M-Pro 的免疫反應性，特別是還原糖的作用更強，是降低蛋白致敏性的潛在有效手段。