不同產(chǎn)地葛根蛋白質(zhì)提取工藝及其功能性研究

唐婷范，楊杰，黃芳麗，程昊，朱家慶，梁杰婷，黃青勇，田玉紅

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

葛根（Pueraria lobata）是豆科植物野葛的干燥根，可分為野葛和粉葛[1]，在我國的大部分省份都有分布。葛根被人贊譽(yù)為“亞洲人參”，具有解表退熱，生津、透疹、升陽止瀉等多種功能。葛根的化學(xué)成分豐富，主要活性成分有大豆素、葛根素等，同時(shí)還含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、多糖和揮發(fā)油等成分。葛根作為中藥其藥用價(jià)值非常高，其藥效的主要成分是葛根當(dāng)中的總黃酮、葛根素、大豆甙元、三帖皂苷和乙酰膽堿等[2]。劉紅芹等[3]認(rèn)為葛根、桑葉、苦瓜、苦蕎配方的提取物對(duì)II型糖尿病具有輔助治療的作用。熊東妮等[4]認(rèn)為葛根對(duì)婦科病具有一定的治療作用。如果挖掘出葛根潛在的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，將葛根制成具有功能性的食物、飲料或者藥物，會(huì)有廣闊的市場前景。

蛋白質(zhì)是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[5]，蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)是由食品在加工、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和消費(fèi)的過程中產(chǎn)生的。這些特征具體包括了蛋白質(zhì)溶解度、持水油性、乳化性、起泡性和膠凝性等。本試驗(yàn)以不同產(chǎn)地葛根為原料，運(yùn)用凱氏定氮法分別測定廣西北海、貴港和柳州葛根中的蛋白質(zhì)含量，并采用普通回流法提取葛根蛋白質(zhì)，計(jì)算葛根蛋白質(zhì)的提取率。并以蛋白質(zhì)提取率為考察指標(biāo)[6]，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法[7]分析提取溫度、提取時(shí)間、液料比以及提取溶劑的pH 值對(duì)提取率的影響。并對(duì)葛根蛋白質(zhì)的功能性做初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根：選用廣西北海野葛、貴港野葛和柳州粉葛。五水硫酸銅：天津市化工三廠有限公司；硫酸鉀、無水碳酸鈉：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、甲基紅指示劑：天津市福成化學(xué)試劑廠；硫酸、鹽酸、硼酸、氫氧化鈉：成都市科隆化學(xué)品有限公司；溴甲酚綠指示劑：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇：東莞市斯巴達(dá)化學(xué)有限公司；碘化鉀：成都金山化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：上海金穗生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

GZX-GF101-4-S 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DFY-600C 搖擺式高速粉碎機(jī)：浙江省溫嶺市大機(jī)械有限公司；GG-17 凱氏定氮裝置：廈門仕福玻璃儀器廠；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市京華儀器有限公司；V2000 可見分光光度計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TDL-80-2B 低速臺(tái)式離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；ZY-LDG12 真空冷凍干燥機(jī)：上海紫裕生物科技有限公司；FSH-2A 可調(diào)高速均質(zhì)機(jī)、AR124CN 電子分析天平：上海舜余恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根蛋白含量的測定

將不同產(chǎn)地的葛根洗凈、烘干和粉碎，然后過40目篩，得到葛根粉。根據(jù)凱氏定氮法[8]分別測定3 種產(chǎn)地葛根粉中蛋白質(zhì)總含量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

稱取（0.005 0±0.000 3）g 牛血清蛋白于燒杯中，用少量水使其溶解，定容到10 mL 容量瓶中，得到濃度為5 mg/mL 的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液[9-10]。

稱取0.75 g 的硫酸銅和3.00 g 的酒石酸鉀鈉溶于250 mL 水中，加入10%的氫氧化鈉溶液150 mL 混勻（加入1.00 g KI 以防止Cu2+自動(dòng)還原成Cu+，生成Cu2O沉淀），最后稀釋到500 mL，得到雙縮脲試劑[11]。

分別準(zhǔn)確移取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中并編號(hào)，然后加入4.0 mL 雙縮脲試劑于（37±2）℃水浴鍋中反應(yīng)30 min后用可見分光光度計(jì)在540 nm 處測其吸光值，空白管調(diào)零。

1.3.3 葛根蛋白的提取工藝

稱取一定量葛根粉，加入一定液料比[10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）]和 pH 值（5、6、7、8、9）的提取溶劑，于一定溫度（30、40、50、60、70 ℃）回流提取一定時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h），將提取液在 3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，取一定上清液加入顯色劑反應(yīng)30 min，用V2000 可見分光光度計(jì)測定吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)提取率[12]。

將剩余上清液的pH 值調(diào)為4.5，然后靜置12 h后，真空離心20 min 得到蛋白沉淀，將蛋白沉淀放入真空冷凍干燥機(jī)[13]，干燥12 h 后得到葛根蛋白樣品，放入干燥皿備用。

1.3.4 蛋白的功能性性質(zhì)測定

1.3.4.1 持油性試驗(yàn)

取10 mL 離心管，稱其質(zhì)量為m0，加入0.1 g 蛋白樣品，其質(zhì)量為m1，再加入金龍魚花生油2 mL，在室溫下振蕩15 min，使其溶解均勻，靜置5 min；用低速離心機(jī)以4 000 r/min 的速度離心15 min，棄去上清液；用濾紙吸干壁上油珠，稱其離心管和吸油蛋白的質(zhì)量為m2。根據(jù)公式計(jì)算出持油力[14]。

式中：m0為空離心管質(zhì)量，g；m1為蛋白樣品質(zhì)量，g；m2為離心管和吸油蛋白樣品質(zhì)量，g。

1.3.4.2 持水性試驗(yàn)

取10 mL 離心管，稱其質(zhì)量為m0，加入0.1 g 蛋白樣品，其質(zhì)量為m1，再加入pH 7 的蒸餾水2 mL，使其攪拌溶解均勻后放在60 ℃水浴鍋中加熱30 min，冷卻。用低速離心機(jī)以4 000 r/min 的速度離心15 min，棄去上清液；用濾紙吸干壁上水珠，稱離心管和吸水蛋白的重量為m2。根據(jù)公式計(jì)算出持水力[14]。

式中：m0為空離心管質(zhì)量，g；m1為蛋白樣品質(zhì)量，g；m2為離心管和吸水蛋白樣品質(zhì)量，g。

1.3.4.3 乳化性試驗(yàn)

稱取0.10 g 蛋白樣品分散于裝有2 mL 蒸餾水的離心管中內(nèi)，再加入2 mL 的金龍魚花生油，振蕩搖勻。用高速均質(zhì)機(jī)下用3 檔均質(zhì)2 min，均質(zhì)結(jié)束后，用低速離心機(jī)在1 500 r/min 的速度下離心5 min，分別測量離心管內(nèi)樣品總高度和乳化層高速。根據(jù)公式計(jì)算出乳化率[15]。

1.3.4.4 起泡性實(shí)驗(yàn)

稱取0.10g 蛋白樣品于10 mL 量筒內(nèi)，加入pH 7的蒸餾水9 mL，在高速均質(zhì)機(jī)下用3 檔均質(zhì)2 min，均質(zhì)結(jié)束后測量泡沫的體積。根據(jù)公式計(jì)算起泡率[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根蛋白質(zhì)總含量

根據(jù)凱氏定氮法測定廣西貴港野葛蛋白質(zhì)含量為12.27%，北海野葛蛋白質(zhì)含量為10.36%，柳州粉葛蛋白質(zhì)含量為9.34%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

由圖1 可知標(biāo)準(zhǔn)方程式為Y=0.063 2X+0.004 8，決定系數(shù)R2=0.999 4，線性情況較好；所以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在0.5 mg/mL～5.0 mg/mL。

精密度試驗(yàn)按照“1.3.3”的步驟方法稱取葛根粉進(jìn)行提取、離心和顯色，同時(shí)做6 個(gè)平行樣，然后用可見分光光度計(jì)在540 nm 處分別測定吸光值，結(jié)果如表1所示。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

根據(jù)表1 可得，平均提取率為（58.49±0.91）%，相對(duì)平均偏差為0.91%，說明該方法精密度好。

加標(biāo)回收率試驗(yàn)按照“1.3.3”的步驟方法稱取葛根粉進(jìn)行提取、離心，同時(shí)做6 個(gè)試驗(yàn)。然后在每個(gè)比色管加入不同體積的2 mg/mL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后顯色。用可見分光光度計(jì)在540 nm 處測定其吸光值。結(jié)果如表2 所示。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery experiments

由表2 可以看到，葛根蛋白提取物的平均加標(biāo)回收率為（98.94±1.69）%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.69%，說明雙縮脲法對(duì)于測量葛根提取物中總蛋白質(zhì)含量真實(shí)可靠，該法可行。

準(zhǔn)確度試驗(yàn)按照“1.3.3”的步驟方法稱取葛根粉進(jìn)行提取、離心和顯色，同時(shí)做6 個(gè)平行樣，然后用可見分光光度計(jì)在540 nm 處測定其吸光值，20 min 內(nèi)每隔2 min 測定一次。結(jié)果如表3 所示。

根據(jù)表3 可得，在20 min 內(nèi)提取液的平均提取率為（59.45±0.54）%，RSD 為 0.54%，結(jié)果表明這種方法穩(wěn)定性較好。

表3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability experiments

2.3 單因素考察結(jié)果

2.3.1 提取溶劑pH 值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

稱取 1.00 g 的葛根粉，加入料液比為 20 ∶1（mL/g）的水，將水 pH 值調(diào)為 5、6、7、8 和 9，于 50 ℃溫度下提取1.5 h，將提取液進(jìn)行離心、顯色和測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溶劑pH 值對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of pH valueon extraction rate of protein

由圖2 可知，pH 值為 5、6、7、8 和 9 時(shí)，葛根蛋白質(zhì)提取率分別為51.00%、52.57%、55.08%、56.37%和49.49%，在 pH 值為 5、6、7、8 時(shí)提取率逐漸升高，在pH 8 時(shí)達(dá)到最高，因?yàn)樵谌鯄A性條件能使蛋白分子結(jié)構(gòu)變得疏松，堿液對(duì)蛋白有促進(jìn)溶解的效果。pH 在8～9時(shí)提取率急速下落和pH 5 時(shí)提取率很低，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在酸度過低和堿性過高下可以使蛋白質(zhì)中的氫鍵斷裂，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[16]，所以提取溶劑pH 8 為佳。

2.3.2 液料比對(duì)提取率的影響

稱取 1.00 g 的葛根粉，加入 pH 8 液料比為 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1 和 30 ∶1（mL/g）的水，于 50 ℃溫度下提取1.5 h，將提取液進(jìn)行離心、顯色和測定，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 液料比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.3 Liquid to material ratio on extraction rate of protein

由圖3 可知，在液料比的影響下，提取率分別為54.72%、55.07%、56.31%、54.95%和54.37%。提取率隨液料比的增加先上升后下降。當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，提取率為最高。這可能是因?yàn)橐毫媳容^低時(shí)，提取溶劑較少，體系分散不均勻，蛋白質(zhì)不能完全溶解[17]，所以當(dāng)提取溶劑的液料比20 ∶1（mL/g）為佳。

2.3.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

稱取 1.00 g 的葛根粉，加入 pH 8 液料比為20 ∶1（mL/g）的水，于 30、40、50、60、70 ℃溫度下提取1.5 h，將提取液進(jìn)行離心、顯色和測定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4 Extraction temperature on extraction rate of protein

由圖4 可知，在提取溫度的影響下，提取率分別為53.28%、54.43%、55.73%、51.97%和50.97%。提取率先緩慢上升，然后在快速下降，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)提取率55.73%為最高。因?yàn)闇囟冗^高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而影響蛋白質(zhì)的提取率[18]，所以當(dāng)提取溫度50 ℃時(shí)為佳。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱取1.00 g 的葛根粉，加入pH 8 液料比為20 ∶1（mL/g）的水。于 50 ℃溫度下提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，將提取液進(jìn)行離心、顯色和測定，結(jié)果如圖5所示。

由圖5 可知，在提取時(shí)間的影響下，提取率分別為50.50%、52.21%、57.63%、56.24%和54.60%。提取率先快速上升然后在緩慢降低，在提取時(shí)間為1.5 h，提取率最高為57.63%。這是因?yàn)樘崛〉臅r(shí)間越長，蛋白質(zhì)的溶出率就越高。但是時(shí)間太長會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[19]，從而影響蛋白質(zhì)的提取，所以當(dāng)提取時(shí)間1.5 h時(shí)為佳。

圖5 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.5 Extraction time on extraction rate of protein

2.4 正交試驗(yàn)及考察結(jié)果

由單因素試驗(yàn)可知對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響較大的3個(gè)因素是提取溶劑的pH 值、提取溫度和提取時(shí)間。每個(gè)因素影響提取率較大的3 個(gè)水平是提取溶劑的pH 6、pH 7 和 pH 8，提取溫度 30、40、50 ℃，提取時(shí)間1.5 h、2.0 h 和2.5 h。所以采取L9（34）的正交表進(jìn)行分析，方案如表4 所示，以葛根蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化蛋白質(zhì)的最佳提取工藝，結(jié)果見表5，其空列為誤差列，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有影響。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment

表5 正交試驗(yàn)及其結(jié)果分析Table 5 Results of the orthogonal experiment

續(xù)表5 正交試驗(yàn)及其結(jié)果分析Continue table 5 Results of the orthogonal experiment

從極差R 分析得因素的主次為A＞C＞B，即提取溶劑pH 值＞提取時(shí)間＞提取溫度；在A 因素中分析得提取溶劑的pH 值得主次為pH 8＞pH 7＞pH 6；在 B 因素中分析可得提取溫度的主次為30 ℃＞40 ℃＞50 ℃；在C 因素中分析可得提取時(shí)間的主次為2.5 h＞2.0 h＞1.5 h。綜上所訴，最優(yōu)方案為A3B1C3，即提取溶劑的pH 8，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度為 30 ℃，提取率為57.28 %。

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)方案和“1.3.3”的提取方法，分別對(duì)廣西北海、貴港和柳州葛根進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取并進(jìn)行其提取率，結(jié)果如表6。

表6 葛根蛋白提取率Table 6 Extraction rate of Pueraria lobata protein

根據(jù)表6 可知，廣西北海野葛蛋白質(zhì)的提取率為58.87%、貴港野葛蛋白質(zhì)的提取率為83.20%和柳州粉葛蛋白質(zhì)的提取率為22.27%。

2.5 葛根蛋白功能性試驗(yàn)

由“1.3.4”的工藝步驟得出葛根蛋白的功能性，然后與大豆分離蛋白的功能性進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表7所示。

表7 葛根蛋白和大豆分離蛋白的功能特性Table 7 Functional properties of puerarin and soy protein isolate

葛根蛋白的持油率高于大豆分離蛋白的持油率；持水率、起泡率和乳化率都比大豆分離蛋白的低，但是相差不大。葛根為豆科植物野葛的干燥根，即葛根蛋白為豆科蛋白的一類，所以葛根蛋白的功能性和大豆分離蛋白的功能性相近。

3 結(jié)論

廣西貴港野葛蛋白質(zhì)含量為12.27%，北海野葛蛋白質(zhì)含量為10.36%，柳州粉葛蛋白質(zhì)含量為9.34%。在最佳的提取工藝條件下廣西北海野葛蛋白質(zhì)的提取率為58.87%、貴港野葛蛋白質(zhì)的提取率為83.20%和柳州粉葛蛋白質(zhì)的提取率為22.27%。同時(shí)葛根蛋白的持水率為4.49 g/g、持油率為4.05 g/g、起泡率為6.67%和乳化率為34.88%。

葛根蛋白屬于植物蛋白，具有脂肪少和膽固醇低的特點(diǎn)，而且葛根蛋白還具有改善心血管疾病、降低膽固醇和預(yù)防慢性疾病的功效。葛根蛋白為豆科蛋白，屬于完全蛋白，是完全可以滿足人體需求的一種蛋白[20]。研究葛根蛋白的功能性質(zhì)對(duì)于我們合理科學(xué)的使用蛋白具有深刻的科研意義，符合當(dāng)今社會(huì)的綠色食品要求。