幾種檢測乳酸菌抑制真菌性能的方法比較

郝湘妹，王宇航，王媛，楊逢源，趙珊珊，張華，宋育超，王雁萍，*

（1.鄭州大學河南省離子束生物工程重點實驗室，農學院，河南鄭州450052；2.鄭州大學河南省離子束生物工程重點實驗室，物理工程學院，河南鄭州450052）

近年來，由于絲狀真菌污染導致的食品發霉現象十分嚴重，在肉類、海產品、乳制品和谷物等食品保鮮中這種現象更加明顯[1]。為了防止食品霉變，研究者們從各個方面尋找合適的防腐劑，通過添加防腐劑抑制未消除的或環境中的真菌生長來避免食品變質[2]。一些抗生素在體內無法代謝導致產生耐藥菌株，一些真菌物種對化學防腐劑也會產生一定的抗藥性。例如，許多青霉屬物種通過其脫羧成反式-1，3-戊二烯而具有降解化學防腐劑山梨酸鹽的能力，產生異味和“煤油樣”味[3]，而且化學防腐劑的積累會對人體造成很大的傷害。因此，使用生物防腐劑被認為是減輕真菌污染的合理解決方案。生物防腐劑包括生物本身及其代謝產物，而作為生物防腐劑最合適的候選物，革蘭氏陽性乳酸菌被廣泛使用[4-6]。參與食物發酵的4 個主要的“核心屬”被定義為乳桿菌屬、小球菌屬、明串珠菌屬和鏈球菌屬[7]。在食品加工過程中，可以通過添加能夠抑制真菌生長的乳酸菌來達到延長食品保質期的目的。

迄今為止，關于抑制細菌的乳酸菌篩選方法報道較多。本研究以真菌作為指示菌株，參考并改良廣泛應用于抑制細菌的乳酸菌篩選方法，以期建立高通量抑制真菌的乳酸菌篩選體系。目前關于乳酸菌抑制真菌的研究方法主要分為體外研究和原位研究，體外研究，如應用濾紙片法、96 孔板法、牛津杯瓊脂擴散法、打孔法及雙層平板劃線法等[8]，前4 種方法適用于檢測菌株發酵上清液的抑菌活性，最后一種方法適用于檢測菌體和發酵產物的抑菌活性。原位研究，比如將乳酸菌添加到面包、酸奶或饅頭中，研究乳酸菌發酵對食物保質期的影響[9-10]。采用體外研究方法測定乳酸菌抑制真菌能力時，不同方法產生的抑菌效果會有很大的差別。黑曲霉（Aspergillus niger）屬于半知菌類曲霉屬，是一種很常見的絲狀真菌，具有絲狀真菌的代表性[11]。本研究通過使用96 孔板法、牛津杯瓊脂擴散法、雙層平板劃線法以及打孔法，研究乳酸菌對黑曲霉的抑制作用，分析并比較幾種抑菌測定方法的靈敏性、簡便性及可行性，為抑制真菌乳酸菌的篩選工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

乳酸菌：L.plantarum ZZUA530、L.plantarum ZZUA-537，由青貯苜蓿樣品中分離得到；指示菌：從苜蓿樣品中分離出來，經鑒定為Aspergillus niger。

1.1.2 培養基

MRS 固體培養基（g/L）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，乙酸鈉 5.0 g，吐溫80 1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳 0.25 g，瓊脂 17.0 g，pH（6.2±0.2），121 ℃ 20 min滅菌；MRS 液體培養基（g/L）：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，乙酸鈉 5.0 g，吐溫 80 1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳 0.25 g，pH（6.2±0.2），121 ℃ 20 min 滅菌；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）（g/L）：馬鈴薯浸粉 3.0 g，葡萄糖 20.0 g，瓊脂 14.0 g，pH（5.6±0.2），121 ℃ 20 min 滅菌。

1.1.3 試劑

0.9%NaCl 溶液：國藥集團化學試劑有限公司；酒石酸溶液：安徽艾博生物科技有限公司。

1.1.4 儀器

D-8 紫外可見分光光度計：南京菲勒儀器有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；BD17 真空厭氧箱：上海然泰生物科技有限公司；ALLEGRA-64R 貝克曼庫爾特Allegra 系列離心機：貝克曼庫爾特商貿有限公司；3020 多功能微孔板讀數儀：上海吉泰依科賽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌發酵上清液的制備

從-80 ℃超低溫冰箱中取出乳酸菌菌株，接種至MRS 固體培養基，30 ℃厭氧培養48 h，挑取單菌落劃線傳代，培養48 h 后，挑取乳酸菌大致等量的一環，分別接入 1 mL MRS 液體中，30 ℃恒溫培養 24 h，4 ℃條件下8 000 r/min 離心5 min，制取乳酸菌發酵上清液，備用。

1.2.2 霉菌孢子懸浮液的制備

從-80 ℃超低溫冰箱中取出黑曲霉菌，接種至PDA培養基，37 ℃培養4 d 后，挑取孢子至0.9%的生理鹽水中，過濾并計數[12]，直至濃度達到1.28×107CFU/mL～1.55×107CFU/mL，備用。

1.2.3 96 孔板法

根據文獻[13]并加以改進，在96 孔板孔中分別取10 μL 濃度為 1.28×107CFU/mL～1.55×107CFU/mL 的霉菌孢子懸浮液加入到190 μL 的乳酸菌發酵上清液或等量的MRS 液體中，30 ℃培養24 h，測定 600 nm 處的吸光值（OD600），利用公式（1）計算抑菌率：

式中：ODLAB表示24 h 之后霉菌孢子在乳酸菌發酵上清液中的OD600；ODcontrol表示24 h 之后霉菌孢子在MRS 液體中的 OD600。

1.2.4 牛津杯瓊脂擴散法

根據文獻[14]進行試驗，每個培養皿傾倒20 mL PDA 培養基作為下層培養基，凝固備用。將霉菌孢子懸浮液稀釋至濃度為 4×105CFU/mL～4.8×105CFU/mL，以3%的接菌量接入50 ℃左右的PDA 培養基，在每個培養皿上層傾倒5 mL 含有霉菌孢子懸浮液的PDA培養基，靜置，待凝固后在其上放置牛津杯，牛津杯中添加200 μL 乳酸菌發酵上清液，對照組僅添加等量的不含乳酸菌的MRS 液體，蓋上陶蓋，37 ℃培養24 h，觀察結果。

1.2.5 打孔法

依照參考文獻[15]步驟，下層傾倒20 mL MRS 固體培養基，待其凝固后，將霉菌孢子懸浮液稀釋至濃度為 4×105CFU/mL～4.8×105CFU/mL，以 3%的接菌量接入50 ℃左右的PDA 培養基，在每個培養皿上層傾倒5 mL 含有霉菌孢子懸浮液的PDA 培養基，靜置凝固后打孔，將乳酸菌發酵上清液添加至孔內，室溫下（22 ℃）放置24 h，然后將平板置于37 ℃培養24 h，觀察結果。

1.2.6 雙層平板劃線法

依照文獻[16]，將乳酸菌菌株在MRS 固體培養基上畫線，30 ℃培養24 h 和48 h。將含有霉菌孢子懸浮液的PDA 培養基傾倒在上層，待其凝固，37 ℃培養24 h，觀察結果。

以上所有試驗步驟均在超凈工作臺內進行，設置多個平行。

2 結果與分析

2.1 96孔板法

霉菌孢子在裝有不同乳酸菌發酵上清液或MRS液體的96 孔板中培養24h 后結果如圖1 所示。

圖1 96 孔板法顯示乳酸菌對黑曲霉的抑菌作用Fig.1 The antifungal effect of LAB on A.niger showed by 96-well plate method

培養24 h 后，目測霉菌孢子在菌株ZZUA530 或ZZUA537 發酵上清液中呈澄清狀態，而在MRS 液體（對照）及其他菌株的發酵上清液中均有大量菌絲生長。因此，通過96 孔板法檢測，菌株ZZUA530 和ZZUA537 均表現出良好的抑菌性能。霉菌孢子的OD600和乳酸菌抑菌率見表1。

表1 霉菌孢子的OD600 和乳酸菌抑菌率Table 1 OD600 of mold spores after 24 h and the inhibition rate of LAB

由表1 可知，霉菌孢子在菌株 ZZUA530 和ZZUA537 的發酵上清液中培養24 h 后溶液的吸光值沒有顯著差別，經計算，菌株ZZUA530 和ZZUA537 的抑菌率分別為89.94%和88.34%。

2.2 牛津杯瓊脂擴散法

將經過96 孔板法篩選到的具有抑菌活性的菌株ZZUA530 和ZZUA537 的發酵上清液加入到牛津杯中培養24 h 后結果如圖2 所示。

圖2 牛津杯瓊脂擴散法顯示乳酸菌對黑曲霉的抑菌作用Fig.2 The antifungal effect of LAB on Aspergillus niger showed by oxford cup agar diffusion method

加入2 株乳酸菌發酵上清液的牛津杯底部透明，無菌絲生長，而對照組牛津杯底部有菌絲生長，呈現白色菌絲狀態，使用這種方法雖然可以觀察到兩株乳酸菌對黑曲霉具有抑制作用，但加入兩菌株發酵上清液的牛津杯周圍沒有出現明顯的抑菌圈，所以抑菌效果不理想。這可能與霉菌孢子懸浮液的濃度太高，或乳酸菌發酵上清液的抑菌物質濃度太低有關。

2.3 打孔法

將經過96 孔板法篩選到的具有抑菌活性的菌株ZZUA530 和ZZUA537 的發酵上清液添加到底層為MRS 固體培養基、上層為含有黑曲霉孢子懸浮液的PDA 培養基孔中，經過室溫（22 ℃）擴散 24 h，在 37 ℃條件下培養24 h 后抑菌效果如圖3 所示。

加入乳酸菌發酵上清液的實驗組和對照組相比，孔徑邊緣均沒有透明的抑菌圈，因而利用此法無法觀察到菌株ZZUA530 和ZZUA537 發酵上清液對黑曲霉的抑制作用，表明利用打孔法在測定乳酸菌抑制真菌能力方面靈敏度較低。

圖3 打孔法顯示乳酸菌對黑曲霉的抑菌作用Fig.3 The antifungal effect of LAB on Aspergillus niger showed by perforation method

2.4 雙層平板劃線法

將經過96 孔板法篩選到的具有抑菌活性的菌株ZZUA530 和ZZUA537 劃線于MRS 固體培養基，分別在培養24 h 和48 h 后于其上傾倒含有霉菌孢子懸浮液的PDA 培養基，37 ℃放置24 h 后抑菌效果如圖4所示。

圖4 雙層平板劃線法顯示乳酸菌對黑曲霉的抑菌作用Fig.4 The antifungal effect of LAB on A.niger showed by doublelayer plate scribe method

在乳酸菌劃線周圍有透明區域，因此，用此法可以觀察到明顯的抑菌圈。與對照組（e）相比，培養24 h（a、c）和培養 48 h（b、d）的乳酸菌對黑曲霉均顯示出抑菌作用。兩株菌株對比而言，菌株ZZUA530 的抑菌作用強于ZZUA537。對于同一菌株來說，培養48 h 的乳酸菌比培養24 h 的乳酸菌抑菌效果更加明顯，這可能與培養時間較長乳酸菌發酵產生的抑菌物質的濃度較高有關。

3 討論

與細菌污染相比，真菌污染更不易被控制，這與一些真菌通過孢子傳播、較易擴散有關，這給防治真菌污染和抑制真菌微生物的篩選工作帶來了困難。乳酸菌被認為是一種相對安全的生物添加劑，因此，建立抑制真菌的乳酸菌篩選體系，篩選高效抑制真菌乳酸菌菌株具有現實意義。本研究以黑曲霉為指示菌，對比幾種抑制真菌的測定方法，為建立高通量抑制真菌乳酸菌的篩選體系提供參考。

在體外研究乳酸菌對真菌的抑制活性中，馬歡歡等[13]通過使用96 孔板法研究8 株乳酸菌對黑曲霉的抑制作用，篩選出一株植物乳桿菌，本研究使用96 孔板法也觀察到了不同乳酸菌對黑曲霉抑制能力的差別，此方法具有簡便快捷的特點。Juodeikiene 等[16]使用牛津杯瓊脂擴散法，將體系置于27 ℃培養3 d～10 d，從6 株乳酸菌中篩選出1 株能夠抑制疣狀青霉菌、鐮刀霉菌等的戊糖片球菌。本研究使用牛津杯瓊脂擴散法測定2 株經過96 孔板法篩選到的具有抑菌活性的乳酸菌發酵上清液的抑菌活性，將體系置于37 ℃培養24 h，雖然在加入乳酸菌發酵上清液的牛津杯底部未見真菌生長，但未觀察到牛津杯周圍出現透明的抑菌圈。這可能與培養體系不同有關，本研究體系的溫度太高比較適宜真菌生長，不易被抑制，也可能與本研究使用的乳酸菌對黑曲霉的抑制能力較弱有關，因此該方法適合測定具有較強抑制真菌能力乳酸菌的抑菌性能。楊海清等[17]將從西藏靈菇中篩選出來的乳酸菌進行培養，將發酵上清液濃縮10 倍，通過打孔法研究濃縮發酵上清液對真菌的抑制作用，其抑菌圈直徑均大于15 mm。本研究采用打孔法檢測2 株經過96 孔板法篩選到的具有抑菌活性的乳酸菌發酵上清液對黑曲霉的抑制作用，結果未觀測到抑菌圈，這可能與發酵上清液中抑菌物質濃度較低有關。Guimaraes 等[18]通過使用雙層平板劃線法篩選出一株能夠抑制黃曲霉的植物乳桿菌，本研究使用雙層平板劃線法檢測2株經過96 孔板法篩選到的具有抑菌活性的乳酸菌對黑曲霉菌的抑制作用，結果也出現明顯的抑菌效果，而且此法能夠顯示使用96 孔板法測定不出的菌株間抑菌能力的差別。因此，與96 孔板法、牛津杯瓊脂擴散法、打孔法對比，雙層平板劃線法具有更高的靈敏度，可以更直觀地觀察到抑菌效果，實驗結果明確可靠。

在乳酸菌對真菌的抑制活性的研究中，除了體外研究，還可進行原位研究，Leyva Salas 等[19]將乳酸菌添加到乳制品中進行酸奶及奶酪發酵，發現可以延遲真菌生長2 d～24 d。本文初步研究了抑制真菌乳酸菌的篩選方法，后續工作將進一步開展乳酸菌的原位抑菌研究。

4 結論

通過研究抑制黑曲霉的乳酸菌的測定方法，發現96 孔板法最為簡單快捷，雙層平板劃線法直觀且更加靈敏，牛津杯瓊脂擴散法和打孔法在檢測抑菌活性較弱的乳酸菌發酵上清液原液時效果不明顯。