超聲波輔助提取對花生蛋白結構與功能特性的影響

耿軍鳳，張麗芬，陳復生，*

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001；2.河南省南街村（集團）有限公司，河南漯河462000）

花生是我國主要的油料作物之一，資源十分豐富。2016 年我國花生年產量達1 728.98 萬噸，居世界首位[1]。花生中蛋白質含量約為25%～35%，且含有大量人體必需氨基酸，其營養價值與動物蛋白相近，易被人體消化和吸收，是一種理想的植物蛋白質資源[2]。與大豆蛋白相比，天然花生蛋白的功能性較差，主要是因為花生榨油過程中經高溫壓榨及提取過程中使用有機溶劑造成了蛋白質發生不可逆變性，從而限制了其在食品工業的應用[3]。研究超聲波輔助提取對花生蛋白結構和功能特性的影響，對拓寬花生蛋白在食品工業上的應用領域具有重大的意義。

超聲波通過與介質之間的相互作用，能夠引起一系列物理化學反應，從而造成空化效應、機械效應和熱效應等[4]。利用超聲波的空化效應，在液體介質中產生空穴氣泡，氣泡破裂導致破裂處的能量釋放，產生局部超高溫（5 000 K）和超高壓（1 000 MPa），位于空化區域的植物細胞組織發生變形、破裂，進而產生增溶作用，有利于充分提取蛋白質等有效成分[5]。與其他提取方法相比，超聲波因具有耗能少、時間短、純度好、效率高等優點而被廣泛用于蛋白質的提取中。超聲波不僅可以提高蛋白質的提取率，在改善蛋白質功能特性方面也有廣泛的應用。Flores-Jiménez 等[6]研究超聲15 min 和30 min 時菜籽蛋白的溶解度、持水性和持油性的變化，在pH 12 超聲30 min 時，其溶解度達到最大值77.96%，而未經超聲處理的菜籽蛋白溶解度僅為74.32%；持水性從2.93 g/g（未經超聲處理）分別降至2.72 g/g 和2.52 g/g，其原因可能是超聲波改變了蛋白質結構，使其表面疏水性增加；同時菜籽蛋白持油性由2.84 g/g（未經超聲處理）分別提高到3.06 g/g 和3.26 g/g，可能是超聲波對脂肪分子中的烴鏈作用后非極性殘基側鏈的暴露，從而使油脂更易吸附。Zhang 等[7]研究超聲波預處理對膠束酪蛋白功能特性和結構的影響。結果表明，超聲波預處理5 min 后，其溶解度從84.14%顯著增加到91.03%；溶解度的增加可能是因為超聲波處理后蛋白質的球狀結構發生改變，使親水基團暴露于水中，增強了水-蛋白質的相互作用。此外，超聲波處理也改善了酪蛋白的乳化性和凝膠性，這些改變將促進其在食品工業中的應用。

綜上所述，利用超聲波技術可降低蛋白質提取過程中的變性程度，并改善蛋白質功能特性。目前，超聲波技術雖廣泛應用于植物蛋白的提取和改性，但在超聲波輔助提取花生蛋白過程中對蛋白質功能特性和結構的影響鮮有報道。因此，本文以花生粕為原料，研究超聲波輔助提取對花生蛋白功能特性的影響，同時通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis ，SDSPAGE）和傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）等方法研究了其對花生蛋白結構特性的影響規律，研究結果為超聲波技術在花生蛋白的深加工利用以及食品加工業的發展中提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生粕：青島長壽食品有限公司。

SCIENTZ-IID 型超聲波細胞粉碎機、DC-2006 節能型智能恒溫槽：寧波新芝生物科技股份有限公司；90-2 型恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；GL-20C 型高速冷凍離心機、TDL-5-A 型離心機：上海安亭科學儀器廠；DDY-6D 型電泳儀：北京市六一儀器廠；LGJ-25 型冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠有限公司；K1100 全自動凱式定氮儀：海能儀器；PHS-3C pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司；FM200 型高剪切分散乳化機：上海弗魯克科技發展有限公司；722S可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；WQF-510 型FTIR：北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

花生粕→按料液比1 ∶10（g/mL）加入三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液（pH 8.5）→攪拌分散→離心（20 min 5 000 r/min）→取上清液→調pH 值至4.5→離心（20 min 5 000 r/min）→收集沉淀→沉淀復溶→調pH 值到7.0→4 ℃透析24 h→冷凍干燥→樣品至4 ℃保存

1.2.2 超聲波處理

將超聲波探頭置于花生粕懸浮液（70 mL）液面下方3 cm 處，用低溫水浴槽控制溫度，超聲波時間為10、20、30、40、50 min；溫度為 5、15、25、35、45 ℃；超聲波功率密度分別為 1.58、3.17、4.75、6.33、7.92 W/cm3；占空比為33%、50%、67%、80%、90%；超聲波處理樣品凍干后備用。

1.2.3 花生粕成分測定

蛋白質含量測定，參照GB/T 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》，轉換系數為5.46；脂肪含量測定，參照GB/T 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；水分含量測定，參照GB/T 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；灰分含量測定，參照GB/T 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》。

1.3 花生蛋白功能性及結構的測定

1.3.1 溶解度的測定

參考趙雪淞等[8]的方法，取花生蛋白樣品0.25 g分散于10 mL 的去離子水中，攪拌1 h，將分散液在3 000 r/min 離心15 min，上清液及花生蛋白樣品蛋白含量測定采用凱氏定氮法定氮，溶解度表達式為：

蛋白質的溶解度/%=上清液蛋白含量/原料中總蛋白含量×100

1.3.2 持水性及持油性測定

準確稱取0.5 g 蛋白樣品，加入10 mL 蒸餾水于50 mL 離心管中，攪拌均勻，于25 ℃室溫放置30 min，然后在5 000 r/min 下離心10 min，除去上清液。

準確稱取1 g 蛋白樣品，加入5 mL 大豆色拉油，攪拌5 min，5 000 r/min 下離心20 min，棄去上層未吸附油，稱質量。

1.3.3 起泡性及泡沫穩定性測定

準確稱取1 g 樣品置于燒杯中，再加入50 mL 去離子水配制成蛋白質溶液（V0），用磁力攪拌器攪拌1 h，再用高速剪切機以10 000 r/min 高速攪拌2 min 后，轉移到100 mL 的量筒中，記錄其在0 min 時的泡沫（V1）和下層液體（V2）體積。將液體體系靜置30 min 后，再次記錄起泡體積（V3）。

式中：V0為原始蛋白溶液體積，mL；V1為 0 min 時泡沫體積，mL；V2為 0 min 時下層液體體積，mL；V3為靜置30 min 后泡沫的體積，mL。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）

借鑒 Achouri 等[9]方法，利用 SDS-PAGE 凝膠電泳測定花生分離蛋白的分子量分布。采用12 %分離膠（pH 8.8）和 5 %濃縮膠（pH 6.8），蛋白樣品溶解于0.05 mol/L 三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液中，沸水加熱5 min 以使蛋白質變性，8 000 r/min 離心，上樣10 μL，凝膠電泳于恒流下進行，在濃縮膠中電流為20 mA，進入分離膠后增至40 mA。凝膠用固定液固定1 h 后，以質量分數為0.1 %的考馬斯亮藍（R250）反應染色2 h，最后用含45%（體積分數）甲醇和10%（體積分數）冰乙酸的脫色液脫色至條帶清晰（12 h），于凝膠成像系統進行成像處理。

1.3.5 傅里葉紅外光譜

將0.01 g 干燥后的花生蛋白樣品與1 g 干燥的溴化鉀研磨至完全均勻，通過HY-12 型壓片機和壓片模具，將樣品混合物壓制成透明薄片，掃描其紅外光譜。在分辨率4 cm-1、掃描次數16 次的條件下，采用全反射裝置測定透明薄片在400 cm-1～4 000 cm-1范圍內的吸收。

1.3.6 巰基和二硫鍵的測定

參照 Beveridge 等[10]和 Gong 等[11]的方法有所改進，稱取0.18 g 花生蛋白用30 mL Tris-甘氨酸緩沖液和10 mL 8 mol/mL 的尿素混勻，磁力攪拌30 min，再10 000 r/min 離心10 min，收集上清液進行測定。測定巰基時，取 4 mL 上清液加入 160 μL Ellman’s試劑（4 mg/mL），在412 nm 處測定吸光度值，以未加蛋白的樣品為空白對照。測定二硫鍵時，取4 mL 上清液加入 8 μL β-巰基乙醇，于 25 ℃保溫 2 h，然后加 10 mL 12%三氯乙酸，在25 ℃恒溫1 h，以10 000 r/min 離心10 min，沉淀用5 mL 12%三氯乙酸清洗3 次，將沉淀溶于6 mL Tris-甘氨酸緩沖液中，取上述4 mL 溶液加160 μL Ellman’s 試劑混勻后，取 1 mL 上清液加 4 mL Tris-甘氨酸緩沖液混合搖勻后，于412 nm 處測定吸光度值，以未加蛋白的樣品為空白對照。

式中：A412為 412 nm 處吸光值；C 為樣品濃度（mg（干物）/mL）。

式中：Q1為還原前的巰基數；Q2為還原后的巰基數。

1.3.7 數據處理

每組試驗數據取3 次結果的平均值，采用Origin－Pro8.5 軟件繪圖，并使用SPSS（20.0）對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助提取對花生蛋白功能性的影響

2.1.1 超聲波輔助提取對花生蛋白溶解度的影響

超聲波輔助提取對花生蛋白溶解度的影響見圖1。

圖1 超聲波輔助提取條件對花生蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasound-assisted conditions on solubility of peanut protein

蛋白質的溶解度反映了蛋白質的變性和聚集，是蛋白質功能性的良好指標[12]。從圖1 中可知，花生蛋白經超聲波處理后溶解度呈現先增后減的趨勢。在超聲功率密度3.17 W/cm3、時間20 min、溫度35 ℃以及占空比50%時，花生蛋白溶解度分別達到最大值。其中在功率密度3.17 W/cm3時，溶解度最大為61.62%，與堿溶酸沉（45.39%）相比提高了16.23%。蛋白質溶解度增加主要是因為超聲波處理后蛋白質表面積增加導致其粒徑減小和蛋白質-水相互作用增強[13]，此結果與Flores-Jiméne 等[6]的研究一致。隨著超聲功率密度的增加，溶解度有所降低，且與超聲時間、溫度和占空比變化趨勢相同，可能是由于變性蛋白質的聚集形成較高分子量的聚集體從而降低了花生蛋白的溶解度[14]。

2.1.2 超聲波輔助提取對花生蛋白持水性的影響

超聲波輔助提取對花生蛋白持水性的影響見圖2。

圖2 超聲波輔助提取條件對花生蛋白持水性的影響Fig.2 Effect of ultrasound-assisted conditions on water-holding of peanut protein

持水性是食品在加工過程中，對原料中的水分及參與產品加工的水分的保持能力。如圖2 所示，隨著超聲功率密度的增加，花生蛋白的持水性呈現出先增加后減小的趨勢，在超聲功率密度為3.17 W/cm3時，花生蛋白的持水性達到最大值為3.01%，比堿溶酸沉（2.06%）增加了0.95%，這可能是因為超聲作用破壞了蛋白質分子內部的非共價鍵使分子內部的疏水性基團暴露于分子表面，從而導致了蛋白質的持水性增大。而隨著超聲功率密度的繼續增加，花生蛋白的持水性有所下降，持水性減小的原因可能是超聲波處理使部分蛋白質變性，可能降低蛋白質與水的結合程度會增加蛋白質的結合程度并降低其表面疏水性[15]。

2.1.3 超聲波輔助提取對花生蛋白持油性的影響

超聲條件對花生蛋白持油性的影響見圖3。

持油性是指蛋白產品吸附油脂的能力。如圖3 所示，隨著超聲功率密度、時間、溫度和占空比的增加，花生蛋白持油性總體上呈現出先上升后下降的趨勢。其中超聲功率密度對花生蛋白持油性的影響最為明顯，在超聲功率密度3.17 W/cm3時，持油性與對照組（堿溶酸沉）相比顯著提高，可能是因于超聲波與脂肪分子中的烴鏈相互作用后非極性殘基側鏈暴露于分子表面，從而導致油脂更易滲出[6]。隨著超聲功率密度的增加，花生蛋白持油性有所下降，與花生蛋白持水性一致，這可能是因為超聲波處理使蛋白質部分變性，結構變得緊密，不溶性蛋白增多，導致其持油性下降，這與超聲波對花生蛋白持水性的研究結果相一致。

圖3 超聲波輔助提取條件對花生蛋白持油性的影響Fig.3 Effect of ultrasound-assisted conditions on oil-holding of peanut protein

2.1.4 超聲波輔助提取對花生蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響

超聲波輔助提取對花生蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響如圖4 所示。

圖4 超聲波輔助提取條件對花生蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響Fig.4 Effect of ultrasound-assisted conditions on foaming and foam stability of peanut protein

蛋白質的起泡性取決于蛋白質在氣-液界面處的差異，而泡沫穩定性取決于在氣泡周圍形成厚粘性層[16]。由圖4 所示，與對照組（堿溶酸沉）相比，經超聲波處理后明顯的改善了花生蛋白的起泡性及泡沫穩定性。其中超聲時間和溫度對花生蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響較為顯著，當超聲時間10min 時，蛋白質起泡性和泡沫穩定性由21%和82.58%分別增加到33%和94.56%；與此同時，在超聲溫度15 ℃時，其起泡性和泡沫穩定性與對照組（堿溶酸沉）相比，分別提高了18%和9.41%；原因可能是超聲波作用對花生蛋白的空間結構造成了破壞，暴露出更多的疏水性基團，同時降低了液體表面張力，使蛋白質能夠充分展開于氣-液界面處，從而提高蛋白質的發泡能力[17]。

2.2 超聲波輔助提取對花生蛋白結構的影響

2.2.1 超聲波輔助提取對花生蛋白SDS-PAGE 電泳的影響

圖5 表示為不同超聲條件輔助提取的花生蛋白樣品的SDS-PAGE 電泳圖。

圖5 超聲波輔助提取條件對花生蛋白SDS-PAGE 的影響Fig.5 Effect of ultrasound-assisted conditions on SDS-PAGE of peanut protein

圖5A 和5 圖D 分別表示不同超聲功率和超聲占空比作用下花生蛋白的電泳圖，從圖中可以看出花生蛋白呈現出典型的花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白II 條帶。與對照組（堿溶酸沉）相比，超聲功率密度和占空比對花生蛋白的亞基并無顯著影響。與對照組（堿溶酸沉）相比較，不同超聲波時間（圖5B）下提取的花生蛋白樣品在分子量為66.2 kDa 附近條帶增加，且分子量為14.4 kDa 處有新的條帶形成。這可能是因為超聲波作用產生的剪切應力和湍流效應，破壞蛋白質分子結構，導致部分蛋白亞基發生了降解[14]，但隨著超聲波時間的延長造成了蛋白質因變性而發生聚基。此外，不同超聲溫度（圖5 C）下提取的花生蛋白樣品的條帶在分子量66.2 kDa 處的條帶略有增加，表明有大分子量的片段生成，這可能是由于超聲作用時產生瞬時極端溫度和壓力使蛋白質發生變性，從而暴露出更多的疏水集團導致蛋白質之間發生聚集[18]。

2.2.2 超聲波輔助提取對花生蛋白二級結構的影響

超聲波對花生蛋白二級結構的影響見表1。

表1 超聲波輔助提取對花生蛋白二級結構的影響Table 1 Effect of ultrasound-assisted on the secondary structure of peanut protein

表1 為不同超聲條件輔助提取對花生蛋白二級結構的影響，在1 600 cm-1～1 700 cm-1范圍內的吸收帶是酰胺I 的特征吸收峰，各子峰與二級結構成分的對應關系為[19-20]：1 650 cm-1～1 658 cm-1，1 610 cm-1～1 640 cm-1，1 660 cm-1～1 700 cm-1，1 640 cm-1～1 650 cm-1處的波數分別對應α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構。

由表1 可知，與對照組（堿溶酸沉）相比，超聲輔助提取的花生蛋白的α-螺旋含量整體有下降的趨勢，β-轉角含量比例增加，β-折疊和無規卷曲結構比例無顯著變化。從表中可以看出，超聲功率密度對花生蛋白二級結構影響不大。隨著超聲時間的延長，花生蛋白的β-折疊和無規卷曲含量變化不顯著，而α-螺旋含量略微減少，β-轉角含量有降低的趨勢，但與對照組（堿溶酸沉）相比仍有增加，在10 min 時花生蛋白β-轉角含量達到最大值為38.19%，可能是超聲作用破壞了蛋白質的空間結構，誘導蛋白質分子發生解折疊，其α-螺旋含量降低，蛋白質結構變得松散加[20]，但隨著超聲時間的增加，蛋白質變性使疏水集團暴露，造成蛋白質聚集，進而使其比例下降。與堿溶酸沉提取的花生蛋白樣品相比，超聲溫度下提取的花生蛋白的無規則卷曲含量無明顯變化，而α-螺旋含量有所下降，β-折疊和β-轉角含量增加，且β-轉角含量在35 ℃達到最大值為37.66%，隨著溫度的升高，β-轉角含量有下降的趨勢，可能是加熱過程中氫鍵斷裂所致[21]。

2.2.3 超聲波輔助提取對花生蛋白巰基（SH）和二硫鍵（-S-S）含量的影響

圖6 表示為不同超聲條件輔助提取的花生蛋白中巰基和二硫鍵含量。巰基和二硫鍵屬于弱次級鍵并維持蛋白質三級結構的，其含量的變化反映了蛋白質的變性程度[11]。

圖6 超聲波輔助提取條件對花生蛋白巰基和二硫鍵含量的影響Fig.6 Effect of different ultrasound-asisted conditions on-SH and-S-S-contents of peanut protein

由圖6 可知，對照組（堿溶酸沉）巰基和二硫鍵含量分別為 3.88 μmol/mL 和 57.23 μmol/mL，在超聲功率密度3.17 W/cm3、時間30 min、溫度15 ℃和占空比50%時，花生蛋白巰基含量分別達到最大值，與對照組相比均有不同程度的提高，在功率密度3.17 W/cm3時達到最大值為5.11 μmol/mL，這可能是因為超聲波空化效應產生的高壓和剪切力使蛋白質中埋藏的巰基暴露出來，因而造成了蛋白質巰基含量的增加[22]。然而隨著超聲功率密度不斷增大時，花生蛋白巰基含量開始降低，可能是因為超聲波使暴露出的巰基其他基團結合形成二硫鍵，導致蛋白質分子聚集，從而降低了巰基含量[23]，其他超聲條件與功率密度變化趨勢相似。經過超聲波輔助提取，花生蛋白中二硫鍵含量與對照組（堿溶酸沉）相比也有顯著的提高，這表明超聲處理后蛋白質分子內部的巰基暴露，增加了巰基與氧氣結合形成二硫鍵的機會，因而造成了二硫鍵含量的增加。

3 結論

研究結果表明，當超聲功率密度為3.17 W/cm3、時間30 min、溫度35 ℃和占空比50%時，花生蛋白的溶解度（43.85%）、持水性（1.65%）和持油性（3.13%）等功能特性較好。由SDS-PAGE 電泳結果顯示，在超聲10 min 時，花生蛋白樣品在分子量為66.2 kDa 附近時條帶開始增加，且在30 min 時條帶最清晰，同時在分子量為14.4 kDa 處有新的條帶形成。通過紅外光譜對花生蛋白二級結構的表征發現，與堿溶酸沉法相比，超聲波輔助提取的花生蛋白的α-螺旋含量減少、β-轉角含量增加，而β-折疊和無規則卷曲含量沒有顯著變化。同時研究發現，超聲波處理后花生蛋白巰基和二硫鍵含量增加，表明超聲波處理后使花生蛋白發生不同程度的變性，進而影響其功能特性如溶解度的變化。本研究結果為超聲波輔助提取蛋白質技術的開發和功能性蛋白產品上的應用提供了理論依據。