銀耳多糖分離提取工藝的優化研究

尹文輝，梁增瀾，張睿，劉鵬，李超，3，*，張澤生，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.天津市輕工業化學研究所有限公司，天津300350；3.天津科技大學食品生物技術教育部工程研究中心，天津300457）

銀耳（Tremella fuciformis Berk），又名雪耳、白耳、白木耳、菊花耳、五鼎芝等，分類學上屬真菌門（Eumycota），擔子菌綱（Basidiomycetes），異隔擔子菌亞綱（Heterobasidiae），銀耳目（Tremellales），銀耳科（Tremellaceae），銀耳屬（Tremella）[1]，是一種好氧性真菌，因其色白如銀，故名銀耳。目前，全球已發現的銀耳屬約有60 余種，廣泛分布于亞熱帶、溫帶及寒帶地區[2]，絕大多數種類的銀耳腐生于闊葉或針葉的原木之上，少數寄生于其他真菌或生長于土壤中[3]。目前，銀耳在我國的福建、浙江、貴州、四川等地區均已實現人工化栽培，其中以福建古田銀耳和四川通江銀耳最為出名[4]。

隨著近年來對銀耳功效研究的不斷深入，大量試驗證據表明銀耳的諸多生理活性均與子實體中的銀耳多糖有關。銀耳多糖是主要以α-（1→3）-D-甘露糖為主鏈的雜多糖，具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、降低血脂及血糖含量、抗血栓、抗病毒、促進蛋白質合成及神經細胞生長、改善記憶力等功效[5-9]。由于銀耳多糖本身無毒副作用，因而近年來頗受關注，是一種具有廣闊開發前景的食用真菌多糖。

本研究采用超聲輔助熱水浸提法來提取銀耳多糖，對影響銀耳多糖得率的主要因素（料液比、浸提溫度、浸提時間和浸提液pH 值）進行單因素及正交試驗優化，得到銀耳多糖的最佳提取工藝條件，并在此基礎之上，對銀耳多糖的醇沉工藝進行優化。研究旨在為銀耳多糖的商業化生產提供一定的理論基礎與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳：市售，經鼓風干燥箱80 ℃烘干后，粉碎機粉碎，過40 目篩并密封后備用。

氫氧化鈉（AR）、無水乙醇（AR）、鹽酸（AR）、硫酸（AR）、葡萄糖（AR）：天津市江天化工技術股份有限公司；苯酚（AR）、無水乙醇（AR）：天津市化學試劑一廠；三氯乙酸（AR）：天津市百世化工有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平（JA 2003）：上海精科天平廠；恒溫水浴鍋（DFD 700）：德陽東方電工有限責任公司；超聲清洗機（KQ-100E 型）：昆山超聲儀器有限公司；pH 計（Delta 320 型）：瑞士 Mettler Toledo 公司；酶標儀（Multiskan Go）：美國 Thermo 公司；冷凍離心機（Avanti JE）：美國Beckman 公司；透析袋（截留分子量8 000 Da）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 銀耳多糖提取液總糖含量的測定—苯酚硫酸法

吸取20 μL 銀耳多糖提取液，去離子水補足至2.0 mL，加入 1mL 6 %（g/mL）的苯酚溶液和 5 mL 濃H2SO4，充分混勻后，25 ℃下靜置 20 min，于 490 nm 處測定吸光度[10]。將測得的OD490帶入標準曲線回歸方程后，得到提取液中銀耳多糖的濃度。

1.3.2 銀耳多糖提取的單因素試驗

在本研究中，采取熱水浸提法結合超聲波輔助法對銀耳多糖進行提取，有利于提高銀耳多糖的溶出[11-12]。采用單因素試驗，分別比較料液比、浸提時間、浸提溫度、浸提pH 值對銀耳多糖提取率的影響。

1.3.2.1 料液比對銀耳多糖提取率的影響。

精確稱取 2.0 g 銀耳粉末，分別加入 60、80、100、120、140mL 去離子水 [1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）]，充分攪拌均勻后，超聲波助溶30 min，于80 ℃條件下恒溫浸提 1 h，加入 10 %（g/mL）三氯乙酸（trichloro-acetic acid，TCA）脫除蛋白 2 h，4 ℃條件下 8 000 r/min離心10 min，取5 mL 上清液透析72 h。透析液經定容后，采用苯酚—硫酸法測定透析袋中的多糖含量，每組試驗3 個平行。

1.3.2.2 浸提溫度銀耳多糖提取率的影響

在確定料液比、浸提時間的基礎之上，取2.0 g 銀耳粉末，加入80 mL 的去離子水，充分攪拌均勻后，超聲波助溶 30 min，分別于 40、60、80、100 ℃條件下浸提1 h，加入 10 %（g/mL）TCA 脫除蛋白 2 h，4 ℃條件下8 000 r/min 離心 10 min，取 5 mL 上清透析 72 h，取 5 mL上清液透析72 h。透析液經定容后，采用苯酚—硫酸法測定透析袋中的多糖含量，每組試驗3 個平行。

1.3.2.3 浸提時間對銀耳多糖提取率的影響

在確定料液比的基礎之上，精確稱取2.0 g 銀耳粉末，加入80 mL 的去離子水溶解后，充分攪拌均勻后，超聲波助溶30 min，于80 ℃條件下恒溫浸提1、2、3、4、5 h，加入 10%（g/mL）TCA 脫除蛋白 2 h，4 ℃條件下8 000 r/min 離心 10 min，取 5 mL 上清透析 72 h，取5 mL上清液透析72 h。透析液經定容后，采用苯酚—硫酸法測定透析袋中的多糖含量，每組試驗3 個平行。

1.3.2.4 浸提pH 值對銀耳多糖提取率的影響。

在確定料液比、浸提時間、浸提溫度的基礎之上，取2.0 g 銀耳粉末，加入80 mL 去離子水，將提取液pH值調至 3、5、7、9、11，充分攪拌均勻后，超聲波助溶30 min，分別放入80 ℃恒溫水浴鍋浸提1 h，加入10%（g/mL）TCA 脫除蛋白 2 h，4 ℃條件下 8 000 r/min 離心10 min，取 5 mL 上清透析 72 h，取 5 mL 上清液透析72 h。透析液經定容后，采用苯酚—硫酸法測定透析袋中的多糖含量，每組試驗3 個平行。

1.3.3 銀耳多糖提取的正交試驗優化

基于單因素試驗基礎之上，以料液比、浸提時間、浸提溫度及浸提液pH 值為因素，設計了四因素三水平L9（34）的正交試驗，以多糖提取率為評價指標。正交試驗設計如表1 所示。

表1 銀耳多糖正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors in orthogonal test of Tremella fuciformis polysaccharide

1.3.4 銀耳多糖的得率計算

銀耳多糖得率/%=m1/m0×100

式中：m0為銀耳原料質量，g；m1為提取液中銀耳多糖總質量，g。

2 結果與分析

2.1 料液比對銀耳多糖提取得率的影響

料液比對銀耳多糖提取得率的影響，試驗結果如圖1 所示。

圖1 料液比對銀耳多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Tremella fuciformis polysaccharides

由圖1 可以看出，隨著料液比的降低，銀耳多糖的得率呈現出逐漸升高，這可能由于隨著水分的增加，銀耳多糖在漿液中的濃度減小，料液間的銀耳多糖濃度梯度差變大，導致存在較大的液相傳質動力，從而有利于銀耳多糖的溶出[12-13]。當料液比為 1 ∶50（g/mL）時，銀耳多糖得率為（8.89±0.18）%，繼續升高料液比對銀耳多糖得率無顯著影響，并且會對后續分離提取帶來一定的困難。因而，選用料液比為1 ∶50（g/mL）用于后續試驗中。

2.2 浸提溫度對銀耳多糖提取得率的影響

浸提溫度對銀耳多糖得率的影響，試驗結果如圖2 所示。

圖2 浸提溫度對銀耳多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of Tremella fuciformis polysaccharide

由圖2 可知，隨著浸提溫度的增加，銀耳多糖得率逐漸升高，這可能由于提取溫度的升高有利于銀耳干品的復水，并且提取溫度越高水分子越活躍，更容易進入細胞內，促使銀耳多糖向提取液中溶出[14]。當水浴溫度達到80 ℃時，銀耳多糖的得率達到（9.15±0.28）%。繼續升高浸提溫度，銀耳多糖的得率未呈現顯著增加，因而從生產成本和工業化實際生產角度考慮，選取浸提溫度為80 ℃來進行后續試驗。

2.3 浸提時間對銀耳多糖提取得率的影響

浸提時間對銀耳多糖得率的影響，試驗結果如圖3 所示。

圖3 浸提時間對銀耳多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of Tremella fuciformis polysaccharide

由圖3 可以看出：隨著浸提時間的延長，銀耳多糖提取得率呈增高趨勢，這可能由于當水浴時間延長時，使銀耳中所含的多糖能夠充分地向水中溶出。浸提時間為4h 時，銀耳多糖得率達到（12.89±0.15）%。隨著浸提時間進一步延長，銀耳多糖的得率增長趨勢不明顯，因而從生產成本和工業化實際生產角度考慮，選取浸提時間為4 h 進行后續研究。

2.4 浸提pH值對銀耳多糖得率的影響

浸提pH 值對銀耳多糖提取得率的影響，試驗結果如圖4 所示。

圖4 pH 對銀耳多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of Tremella fuciformis polysaccharide

由圖4 可知，隨著浸提液pH 值的升高，銀耳多糖的得率呈先逐漸升高的趨勢，當浸提液的pH 值為11 時，銀耳多糖的提取得率達到（15.11±0.21）%，繼續升高浸提液pH 值對銀耳多糖提取得率無顯著影響。這可能是由于銀耳多糖的主要成分是中性多糖和酸性多糖，在中性條件下一部分酸性多糖不能繼續溶出，因此在堿性條件下進行，可使得多糖的提取得率顯著提高[15]。

2.5 銀耳多糖提取正交試驗結果

在前期單因素試驗基礎之上，為進一步優化提取工藝條件，選取料液比（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）和浸提pH（D）作為考察因素，采用四因素三水平L9（34）正交試驗設計優化工藝條件。正交試驗結果如表2 所示。

表2 銀耳多糖提取正交試驗結果表Table 2 The orthogonal results of polysaccharide extraction from Tremella fuciformis

由表2 可知：在9 組試驗中熱水浸提法提取銀耳多糖的最佳提取條件為A2B2C3D1，即料液比為1∶50（g/mL），浸提溫度為 80 ℃，浸提時間為 4.5 h，pH 值為 10 時，銀耳多糖得率最高，銀耳多糖得率為（16.25±0.37）%。極差R 的大小反映各因素對指標影響程度，根據表3 極差分析可知，極差 RA＞RB＞RD＞RC，表明料液比（A）對銀耳多糖的提取率影響最大，其次是浸提溫度（B），而浸提時間（C）和浸提pH 值（D）對銀耳多糖的提取得率影響相對較小。由表3 方差分析可知，料液比（A）對銀耳多糖的得率具有顯著影響（p＜0.05）。

表3 方差分析表Table 3 ANOVA analysis

3 結論

本研究采用超聲輔助熱水浸提法提取銀耳多糖，分析料液比、浸提溫度、浸提時間和浸提液pH值影響對銀耳多糖提取得率的影響，并在單因素試驗基礎之上，采用L9（34）正交試驗進行提取工藝優化。結果表明最佳提取工藝條件為：料液比1 ∶50（g/mL），浸提溫度80 ℃，浸提時間4.5 h，pH 10，其中料液比對銀耳多糖得率具有顯著性影響（p＜0.05）。在此條件下，銀耳多糖得率達到（16.25±0.37）%。