蛹蟲草多糖的提取工藝優化及其抗氧化活性研究

吳楊洋，亓小妮，謝苗，李曉迪，陳韻，杜秀菊，*

（1.聊城大學生命科學學院，山東聊城252000；2.聊城市水城中學，山東聊城252000）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北蟲草、北冬蟲夏草等，屬于真菌門，子囊菌亞門，核菌綱，球殼目，麥角菌科，蟲草屬，是一種具有多種藥理功能的食藥用菌[1]。蛹蟲草含有蟲草素、蟲草多糖、蟲草多肽和核苷類等生物活性成分[2]，其中多糖是其主要的活性物質之一[3]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌活性、降血糖和提高免疫力等[4-8]生物活性，具有很高的藥用和保健價值。

目前，多糖主要的提取方法有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶輔助提取法等[9-10]，其中熱水浸提法是最為常用的方法。熱水浸提法工藝簡單、操作簡便、成本低等優勢[11]，所以本研究采用熱水浸提法。

在單因素試驗的基礎上，結合響應面試驗對蛹蟲草的提取工藝進行優化。對蛹蟲草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides，CMP）進行不同濃度的乙醇分級得到 CMP20、CMP40、CMP60 和 CMP80，并對不同多糖組分含量（總糖、還原糖和蛋白含量）及體外抗氧化活性（總還原力、DPPH 自由基和羥自由基的清除率）進行比較，為將來的藥用和保健產品的開發提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草：沈陽市于洪區海榮食用菌種植基地。

濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、抗壞血酸（VC）：天津市風船化學試劑科技有限公司；無水乙醇：煙臺遠東精細化工有限公司；DPPH：美國Sigma 公司；牛血清蛋白：Solarbio 公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機（PJ-04A）：海助邦貿易有限公司；可見分光光度計（721 型）：上海佑科一起儀表有限公司；高效離心機（JKYG5J05）：貝克曼庫爾特商貿有限公司；旋轉蒸發儀（RE-2000B）：上海亞榮生化儀器廠；循環水式多用真空泵（SHZ-D-III）：鄭博科儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖的制備

蛹蟲草→烘干→粉碎過100 目篩→95 %酒精浸泡（2 次，24 h/次）→抽濾→濾渣烘干→取樣加水攪勻→熱水浸提→抽濾→濃縮至1/4→醇沉（80%）→4 ℃靜置過夜→離心（3 000×g，10 min）→烘干→蛹蟲草粗多糖（CMP）。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 提取時間對提取得率的影響

取 1 g 蛹蟲草粉，固定液料比 30 ∶1（mL/g）和提取溫度 80 ℃的條件下，考察不同時間（60、90、120、150、180 min）對蛹蟲草多糖提取得率的影響，確定最佳提取時間。

1.3.2.2 提取溫度對提取得率的影響

取 1 g 蛹蟲草粉，固定液料比 30 ∶1（mL/g）和提取時間 120 min 的條件下，考察不同溫度（50、60、70、80、90 ℃）對蛹蟲草多糖提取得率的影響，確定最佳提取溫度。

1.3.2.3 液料比對提取得率的影響

取1 g 蛹蟲草粉，固定提取溫度80 ℃和提取時間120 min 的條件下，考察不同液料比[10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）]對蛹蟲草多糖提取得率的影響，確定最佳液料比。

1.3.3 響應面試驗

根據單因素試驗獲得的結果。采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件中的Box-Benhnken 組合設計法，將A 提取溫度（℃）、B 液料比（mL/g）、C 提取時間（min）作為自變量，提取得率為響應值，進行試驗分析，得到蛹蟲草多糖提取的最優工藝參數。試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面設計因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3.4 多糖乙醇分級

取蛹蟲草粉200 g，在最優的條件下獲得蛹蟲草粗多糖（CMP）。取一定量的CMP，加適量水復溶，充分溶解后邊攪拌邊加入乙醇至濃度為20%，4 ℃靜置過夜，離心（7 000 r/min，10 min），收集沉淀，烘干得到CMP20；離心后的溶液繼續加入乙醇至濃度分別為40%、60%和80%，按上述步驟進行處理，分別得到CMP40、CMP60 和 CMP80[12]。

1.3.5 多糖組分含量的測定

參考張惟杰[13]的方法測定總糖含量，還原糖含量；參考路蘋等[14]的方法測定蛋白質含量。

多糖含量/%=總糖含量/%－還原糖含量/%

1.4 多糖抗氧化活性的測定

1.4.1 總還原力

參考Zhao 等[15]，田淑雨等[16]的方法。取不同濃度的樣品液1.0 mL，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）2 mL（pH 6.6，0.2 mol/L），2 mL 的 1%鐵氰化鉀溶液于試管中，混勻，50 ℃下反應20 min 后加入10%三氯乙酸溶液 2 mL，離心（7 000 r/min，10 min）。分別取2.5 mL 上清液、超純水和1.0 mL 0.1%三氯化鐵溶液于試管中，混勻后在室溫（25 ℃）下靜置10 min。在700 nm 波長下測其吸光值為A。以VC作為陽性對照。設3 個平行試驗，取均值。

1.4.2 DPPH 自由基清除能力

參照 Sirine 等[17]、Du 等[18]的方法，并稍作修改。取1.0 mL 不同質量濃度的樣品液于試管中，加入1.0 mL DPPH 無水乙醇溶液（0.2 mmol/L），混勻，常溫下避光反應30 min 后，在517 nm 處測吸光值。以VC作為陽性對照。設3 個平行試驗，取均值。DPPH 自由基清除率I（%）的公式為：

式中：Ai為樣品液和DPPH 混合液的吸光值；Aj為樣品液和無水乙醇混合液的吸光值；A0為DPPH 和無水乙醇混合液的吸光值。

1.4.3 羥自由基清除能力

參照 Smirnoff 等[19]、Chen 等[20]方法，并稍作修改。取1.0 mL 不同質量濃度的樣品液，30 % H2O2溶液（4 mmol/L，1 mL），FeSO4溶液（4 mmol/L，1 mL），水楊酸無水乙醇溶液（4 mmol/L，1 mL）于試管中，混勻，37 ℃下避光反應 30 min 后離心（7 000 r/min，10 min），在510 nm 處測上清液的吸光值。以VC作為陽性對照。設3 個平行試驗，取均值。羥自由基清除率I（%）的公式為：

式中：Ai為樣品液和水楊酸的吸光度值；Aj為無水乙醇替換水楊酸的吸光值；A0為蒸餾水替換多糖溶液的吸光值。

1.5 數據處理

所有數據重復3 次，試驗結果的均值±標準偏差，采用SPSS 軟件進行處理；響應面試驗相關數據分析采用Esign-Expert 8.0.6.1 軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對多糖得率的影響

提取時間對蛹蟲草多糖提取得率的影響見圖1。

圖1 提取時間對蛹蟲草多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of C.militaris polysaccharides

在提取時間小于120 min 時，提取得率隨時間的增加有明顯增加；在120 min 時，提取得率最高。超過120 min 后，提取得率出現小幅度的下降。因此，最佳提取時間在120 min 左右。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響

提取溫度對蛹蟲草多糖提取得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對蛹蟲草多糖提取得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of C.militaris polysaccharides

提取溫度在50 ℃～80 ℃內，提取得率隨著溫度的升高而增大；當提取溫度超過80 ℃時，提取得率出現下降的趨勢，這可能是由于溫度不斷升高，導致多糖部分水解[21]。因此，最佳提取溫度應控制在80 ℃左右。

2.1.3 液料比對多糖得率的影響

液料比對蛹蟲草多糖提取得率的影響見圖3。

圖3 液料比對蛹蟲草多糖提取得率的影響Fig.3 Effects of water to raw material ratio on the yield of C.militaris polysaccharides

液料比的大小對蛹蟲草多糖多糖提取得率有一定的影響，隨著液料比增大多糖得率增大在30 ∶1（mL/g）時達到最大值，之后隨著液料比的增大蛹蟲草多糖提取得率降低。因此，最佳液料比為30 ∶1（mL/g）。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果，采用Design-Export 軟件中的Box-Benhnken 組合設計法確定蛹蟲草多糖提取得率設計方案。選取提取溫度（A）、液料比（B）和提取時間（C）3 個因素，試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 The designs and results of Box-Behnken test

2.2.2 模型方程建立與顯著性檢驗

采用Design-Expert 軟件對試驗結果進行分析，擬合回歸方程為：Y=7.79＋0.25A＋0.20B＋0.15C－0.088AB＋0.11AC－0.038BC－0.34A2－0.23B2－0.33C2。其回歸模型方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 The regression model of variance analysis results

續表3 方差分析結果Continue table 3 The regression model of variance analysis results

由表3 可知，該模型P＜0.001，表明回歸模型極顯著；回歸模型的失擬項P＝0.334 1＞0.05 不顯著，表明選用的二次回歸模型是適當的；模型相關系數R2＝0.987 6，校正確定系數Adj R2＝0.971 7，說明試驗測定值和預測值之間的相關性較高。CV＝0.89＜10%，說明試驗的可行度和精確度高。由表3 的P 值可知，提取時間、液料比和提取溫度對蛹蟲草多糖的提取得率均達到極顯著水平（P＜0.001）。

2.2.3 交互作用影響結果

根據二次方程模型分別作出試驗因素間交互作用立體曲面圖和等高線圖，考察在某個因素固定不變的情況下，其他兩個因素的交互作用對蛹蟲草多糖提取得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度、液料比和提取時間對蛹蟲草多糖提取得率的影響Fig.3 The effects of extracyion temperature，water to raw material ratio and extraction time on the C.militaris polysaccharides extraction yield

等高線的形狀為橢圓表示因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[22]。立體曲面圖都呈開口向下的拋物面，說明溫度、液料比和時間在本試驗數據范圍內，對蛹蟲草多糖的提取得率均存在最優值。利用二次方程模型分別對參數進行求導，得到最佳條件為溫度83.63 ℃、液料比33.40 ∶1（mL/g）和時間127.78 min，此時的預測蛹蟲草提取得率為7.89%。為方便實際操作，將工藝參數修正為溫度84 ℃、液料比33 ∶1（mL/g）和時間 128 min，在此條件下，經 3 次平行試驗，得蛹蟲草多糖提取得率平均值為7.83%，與理論預測值的相對誤差為0.77%，誤差較小，說明響應面優化蛹蟲草多糖提取工藝是有效可行的。

2.3 不同多糖組分含量的比較

在最優條件下得到蛹蟲草粗多糖（CMP），CMP 經過不同濃度乙醇分級得到CMP20、CMP40、CMP60 和CMP80，其得率、組分含量見表4。

表4 不同蛹蟲草多糖提取得率與組分含量的比較Table 4 Extraction yields，components content of various polysaccharides from C.Militaris %

CMP 的提取得率、多糖和蛋白含量分別為7.83%，31.79%和3.11%；CMP80 得率最高，蛋白含量最低，分別為 25.23 %和1.47 %；CMP40 多糖含量最高（58.49%）。

2.4 不同多糖抗氧化活性的比較

不同蛹蟲草多糖抗氧化活性的比較見表5。

表5 不同蛹蟲草多糖抗氧化活性的比較Table 5 EC50 values and RP0.5AU values of various polysaccharides from C.militaris in antioxidant activity

2.4.1 總還原力

還原力通常被用來作為測定多糖抗氧化活性的重要指標[23]見圖4 和表5。

圖4 不同蛹蟲草多糖的還原力Fig.4 The reducing powerof various C.militaris polysaccharides

當樣品濃度在 62.5 μg/mL～1 500 μg/mL 范圍內，5 種多糖均呈現濃度效應依賴性，隨濃度的增大，還原力越強；5 種多糖的還原力大小順序為：CMP60＞CMP＞CMP20＞CMP80＞CMP40，CMP60 還原力最大，CMP40最小，RP0.5AU分別為 2.35 mg/mL 和 4.76mg/mL。

2.4.2 清除DPPH 自由基的能力

不同多糖DPPH 自由基的清除率和EC50 值見圖5 和表 5。

圖5 不同蛹蟲草多糖的DPPH 自由基清除率Fig.5 The scavenging rates of DPPH radical of various C.militaris polysaccharides

當樣品濃度在 62.5 μg/mL～1 500 μg/mL 范圍內，隨著濃度的增加，5 種多糖的清除力均表現出增強趨勢，表明5 種多糖均有抗氧化活性；5 種多糖對于DPPH 自由基的清除率高低順序為：CMP60＞CMP20＞CMP＞CMP80＞CMP40，CMP60 清除 DPPH·的能力最強，CMP40 最弱，EC50分別為 0.84（mg/mL）和 1.66（mg/mL）。

2.4.3 清除羥自由基的能力

不同多糖羥自由基的清除率和EC50值見圖6 和表5。

圖6 不同蛹蟲草多糖的羥自由基清除率Fig.6 The scavenging rates of hydroxyl radical of various C.militaris polysaccharides

當樣品濃度在 62.5 μg/mL～1 500 μg/mL 范圍內，5種多糖的清除率均呈現明顯的濃度依賴性，表明5種多糖均具有羥自由基清除活性；5 種多糖對于羥自由基的清除活性高低順序為：

CMP80 ＞ CMP ＞ CMP60 ＞ CMP20 ＞ CMP40，其中CMP80 清除·OH 的能力最強，CMP40 最弱，EC50分別為 0.90 mg/mL 和 2.38 mg/mL。

3 結論

采用響應面法對蛹蟲草多糖（CMP）提取得率進行優化，考察提取溫度、液料比、提取時間對蛹蟲草提取得率的影響，得到最佳工藝條件為：提取溫度84 ℃、液料比 33 ∶1（mL/g）和提取時間 128 min，在此條件下，CMP 實際提取得率為7.83%，與預測值的誤差較小。因此，此優化模型具有一定的參考價值。

在最優提取條件下，獲得CMP，并進行乙醇分級沉淀，得到 CMP20、CMP40、CMP60 和 CMP80。CMP20、CMP40、CMP60 和 CMP80 的得率分別為：7.06 %、15.07%、17.83%和25.23%。其中，CMP80 的得率最高，蛋白含量最低（僅為1.47%）；CMP40 多糖含量最高，蛋白含量同樣最高，分別為58.49%和3.79%。

抗氧化試驗結果表明，5 種蛹蟲草多糖均具有一定的抗氧化活性，且具有一定的濃度依賴性。其中，CMP60 的還原力和DPPH 自由基的清除率均最高，RP0.5AU、EC50分別為 2.35 mg/mL 和 0.84 mg/mL；CMP80的羥自由基的清除率最高，EC50分別為0.88 mg/mL；CMP40 在還原力、清除DPPH 自由基和羥自由基能力均為最弱。