發酵法制取藍莓果渣可溶性膳食纖維工藝優化及其特性分析

杜斌，馮軍，李苗苗，周笑犁，孫情，孟令帥

（貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005）

藍莓（blueberry），又稱越橘，杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium L.）植物，其果實富含多種營養物質，有著“水果皇后”的美譽[1-2]。同時，藍莓果實中富含具有抗氧化、抗癌和抗炎作用的多酚類化合物和多糖類物質，因此有著極強的藥用價值及營養保健功能[3-5]，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一，具有廣闊的開發應用前景。近年來，藍莓種植面積在貴州省逐年擴大，黔東南州已成為西南地區乃至全國的重要藍莓種植基地，其藍莓深加工產業也隨之發展迅速，而藍莓皮渣作為加工后的的副產物也隨之増加。研究發現，藍莓果渣中依然含有大量的營養成分，如花青素，有機酸，膳食纖維等[6]。而目前對于藍莓皮渣通常以廢棄物的形式丟棄，這樣不但會形成巨大的環境壓力，同時也造成了資源的巨大浪費。因此，對于藍莓皮渣進行的有效處理，成為提高藍莓綜合利用價值必然的發展趨勢。

膳食纖維（dietary fiber，DF）是既不能被胃腸道消化吸收，也不能產生能量的多糖類物質的總和。因其重要的生理作用被營養學界補充認定為第七類營養素。研究發現膳食纖維具有防止排泄系統疾病、預防肥胖癥、降血壓、改善腸道菌群等功能，而這些功能又都與可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）有很大的關系[7-10]。目前，化學法是提取膳食纖維最為常見的方法，雖然其具有制備成本較低等優點，但在處理過程中帶入大量陰陽離子，制取的膳食纖維含量較低，色澤差，給膳食纖維的進一步利用帶來不利影響。本研究以藍莓藍莓果渣為原料，以乳酸菌為發酵菌種，采用微生物發酵法制備藍莓果渣可溶性膳食纖維，為藍莓果渣資源的高值轉化利用，延伸藍莓加工產業鏈，提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓果渣：貴州麻江藍莓經榨汁等加工后的副產物，由貴陽學院貴州省高校功能食品重點實驗室-20 ℃冷凍保存；植物乳桿菌-YRA7：分離自侗族傳統酸肉[11]，貴陽學院貴州省果品加工工程技術研究中心實驗室保存；嗜酸桿菌：中科院微生物研究所菌種保藏中心；MRS 培養基：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

AUW120D 電子分析天平：日本島津公司；TGL-16C 高速臺式離心機：北京市永光明醫療儀器廠；SHA-B 數顯水浴恒溫振蕩器：常州澳華恩斯儀器有限公司；LDZX-30KBS 高壓滅菌鍋：上海申安有限公司；SPX-250B-Z 生化培養箱：上海博訊實業有限公司；SW-CJ-1G 超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司

1.3 工藝流程

藍莓果渣→調配→滅菌→接種→發酵→滅活→離心取上清液→醇析→抽濾→干燥→SDF

200 mL 錐形瓶中加入20 g 藍莓果渣，按一定料液比加入蒸餾水，并分別加入2%的脫脂奶粉和白砂糖，混合均勻后滅菌；冷卻至室溫25 ℃后，按一定的接種量接入發酵菌種，在一定溫度下發酵一定時間后取出，5 000 r/min 離心15 min，收集上清液；向上清液中加3 倍體積的95 %乙醇，抽濾分離SDF，干燥至衡中后稱重并記錄，所得產物為藍莓果渣SDF。

1.4 試驗方法

1.4.1 發酵菌種的培養

取植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌（1 ∶1 混合菌種）接入MRS 培養基，37 ℃培養 24 h～48 h，采用平板計數法計數，調整細菌數含量在107CFU/mL～108CFU/mL。

1.4.2 單因素試驗

1.4.2.1 料液比對藍莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍莓果渣置于250 mL 錐形瓶內，按料液比 1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL），pH 值為 6.0，接種量10%，37 ℃發酵36 h，測定SDF 含量。

1.4.2.2 發酵時間對藍莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍莓果渣置于250 mL 錐形瓶內，按料液比 1 ∶5（g/mL）pH 值為 6.0，接種量 10%，37 ℃分別培養 24、36、48、60、72 h，測定 SDF 含量。

1.4.2.3 發酵溫度對藍莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍莓果渣置于250 mL 錐形瓶內，按料液比 1 ∶5（g/mL），pH 值為 6.0，接種量 10%，分別調整溫度為 28、31、34、37、40、43 ℃發酵 36 h，測定 SDF含量。

1.4.2.4 pH 值對藍莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍莓果渣置于250 mL 錐形瓶內，按料液比 1 ∶5（g/mL），接種量 10%，分別調整 pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，37 ℃發酵 36 h，測定 SDF 含量。

1.4.2.5 pH 值對藍莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍莓果渣置于250 mL 錐形瓶內，按料液比 1 ∶5（g/mL），pH 值為 6.0，分別按接種量 6%、8%、10%、12%、14%接入發酵菌種，37 ℃發酵36 h，測定SDF 含量。

1.4.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，每個因素選取3 個對SDF 得率影響較大的水平，以SDF 得率為指標，選取五因素三水平的L18（35）正交試驗進行工藝條件優化，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4.4 藍莓果渣SDF 持水力和膨脹力分析

1.4.4.1 持水力分析

參照周笑犁等的方法進行[12]，準確稱量質量為1.00 g（m1）的 SDF 樣品，并將其加入 20 ℃的去離子水中1 h。將其倒入濾紙漏斗上過濾，待水滴干后，然后轉移至質量為m2的表面皿，準確稱其質量（m3）。

1.4.4.2 溶脹性分析

稱取質量為1.000 0 g（m）的SDF 樣品，將其置于20 mL 量筒中，測量體積（v1），準確吸取 10 mL 蒸餾水于量筒中，均勻搖動，在室溫25 ℃下靜置24 h 后，讀取 SDF 膨脹后的體積（v2）。

1.4.5 藍莓果渣SDF 吸附性能分析

1.4.5.1 藍莓果渣SDF 對油脂的吸附作用

參照Sangnark 等[13]的方法進行。分別取1.00 g（W1）SDF 于離心管中，各自加入食用花生油（不飽和脂肪）或豬油（飽和脂肪），室溫25 ℃靜置1 h，用尼龍網（重量為W2）過濾收集沉淀，稱取濕重W3。

1.4.5.2 藍莓果渣SDF 對葡萄糖的吸附作用

稱取1.00 g 樣品于50 m L 的離心管中，加入20 mL的 50 mmol/L 的葡萄糖溶液，室溫25 ℃靜置2 h，6 000 r/min 離心20 min，采用DNS 法測定上清液中葡萄糖的濃度，根據反應前后的濃度差別計算藍莓果渣SDF 對葡萄糖的吸附量[14-15]。

1.4.5.3 藍莓果渣SDF 對亞硝酸鹽的吸附作用

在250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 100 μmol/L NO2-溶液和一定量的膳食纖維，調整pH 值為7.0，于室溫下振蕩2 h 后，取1 mL 樣液按鹽酸萘乙二胺方法測定其中NO2-含量，計算吸附后溶液中殘余NO2-吸附量[14-15]。

NO2-吸附量=（吸附前 NO2-含量- 吸附后 NO2-含量）/膳食纖維質量。

1.5 數據統計分析

數據用平均值±標準差表示。用SPSS 22.0 進行統計分析，以p＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 料液比對藍莓果渣SDF得率的影響

在微生物發酵過程中，料液比過低而導致菌種和原料接觸不充分，使發酵不徹底，而過高則不利于乳酸菌菌體產酶代謝[14，16]。料液比對可溶性膳食纖維產率的影響見圖1。

圖1 料液比對可溶性膳食纖維產率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the SDF yield

由圖1 可知，隨著溶劑體積的增大，藍莓果渣SDF的得率也隨之增加，當液料比為 1 ∶5（g/mL）時，SDF得率顯著增加，明顯高于其他各組（p＜0.05）。因此，確定最佳料液比為 1 ∶5（g/mL）。

2.2 發酵時間對藍莓果渣SDF得率的影響

發酵時間對可溶性膳食纖維產率的影響見圖2。

圖2 發酵時間對可溶性膳食纖維產率的影響Fig.2 Effects of fermentation time on the SDF yield

如圖2 所示，藍莓果渣SDF 得率隨著發酵時間延長而升高，發酵到48 h 后，3 個組間SDF 得率均差異不顯著，并且在72 h 出現了小幅下降（p＞0.05）。可能是由于發酵時間過長，菌種增長致使發酵產物（如乳酸等）不斷的積累，使發酵體系pH 值不斷下降，果膠在水中被氫離子水解，同時在酸性環境下，使菌體產酶效果下降從而導致發酵能力的下降所致[14，16-17]。因此，確定最佳發酵時間為48 h。

2.3 發酵溫度對藍莓果渣SDF得率的影響

發酵溫度對可溶性膳食纖維產率的影響見圖3。

由圖3 可知，隨著發酵溫度的上升，SDF 得率隨之增加，37 ℃時SDF 得率最高達12.80%。當溫度超過37 ℃時，SDF 得率開始顯著下降（p＜0.05）。這一現象一方面可能是由于溫度升高導致SDF 分子的自身結構遭到破壞[18]，另一方面溫度過高會抑制乳酸菌的生長不利于發酵的進行[14，16]。因此，選擇最佳發酵溫度為37 ℃。

圖3 發酵溫度對可溶性膳食纖維產率的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on the SDF yield

2.4 pH值對藍莓果渣SDF得率的影響

pH 值對可溶性膳食纖維產率的影響見圖4。

圖4 pH 值對可溶性膳食纖維產率的影響Fig.4 Effects of pH on the SDF yield

由圖4 可知，在pH 值為4.0 時，發酵速度較慢，且SDF 得率較低（p＜0.05）。pH 值為 5.0 和 6.0 是，SDF 得率最高，兩組差異不顯著（p＞0.05），且明顯高于其他各組（p＜0.05）。而當 pH 值 高于 6.0 時，得率迅速下降（p＜0.05），提示發酵菌種乳酸菌具有較強的耐酸性，在偏酸的環境下進行發酵適于它們的生長和代謝，而當pH值升高時，抑制了菌體的自身生長，使菌體產酶效果下降從而導致發酵能力下降。因此，選擇6.0 為最佳發酵pH 值。

2.5 接種量對藍莓果渣SDF得率的影響

接種量對可溶性膳食纖維產率的影響見圖5。

如圖5 所示，隨著接種量的增加，藍莓果渣SDF得率不斷增大，當接種量為12%時，SDF 得率最高（p＜0.05）。當接種量大于12%時，SDF 得率明顯下降（p＜0.05）。提示，接種量低，菌體生長緩慢，發酵不徹底。而接種量過高，則導致菌體生長過于旺盛，使培養液營養快速消耗，引發后續發酵動力不足，SDF 得率下降[16]。因此，確定12%接種量較適宜。

圖5 接種量對可溶性膳食纖維產率的影響Fig.5 Effects of inoculation quantity on the SDF yield

2.6 發酵法制取藍莓果渣可溶性膳食纖維工藝的優化

通過對各個單因素進行初步分析后，選取發酵時間、料液比、接種量、發酵溫度和pH 值這5 個因素，以單因素試驗為基礎，以藍莓果渣SDF 得率為指標進行正交優化試驗。試驗結果及直觀分析見表2。

表2 正交試驗結果分析表Table 2 The orthogonal experiment results analysis table

由表2 極差分析可知，影響藍莓果渣SDF 得率的各因素主次順序為B＞A＞E＞C＞D，即料液比＞接種量＞pH 值＞發酵溫度＞發酵時間。方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

由表3 方差分析表可以看出，料液比對藍莓果渣SDF 得率影響顯著。由正交試驗結果分析可得發酵法制備藍莓果渣SDF 的最適工藝條件為A2B3C1D2E2，即接種量 12%、料液比 1 ∶6（g/mL）、發酵溫度 34 ℃、發酵時間48 h、pH 6.0。在此條件下進行驗證試驗，結果可得藍莓果渣SDF 的平均得率可達到15.92%，可溶性膳食纖維產品呈淡紫色、質構蓬松、無味。

2.7 藍莓果渣SDF持水力和膨脹力

作為衡量膳食纖維品質的重要指標，水力和膨脹力值越大就表明其吸附性能越強，并且較高的持水力有利于防止便秘和結腸癌的發生[19-20]。膳食纖維特性分析見表4。

由表4 可知，發酵法制備的藍莓果渣可溶性膳食纖維的持水力和膨脹力均高于果渣組（p＜0.05）。同時，吸附能力試驗結果顯示，藍莓果渣可溶性膳食纖維對油脂、葡萄糖以及亞硝酸鹽的吸附能力均高于原果渣。其中對油脂的吸附能力為（2.35±0.06）（g/g）（不飽和脂肪）和（1.67±0.05）（g/g）（飽和脂肪），均高于鐘希瓊等報道的米糠、甘薯、馬鈴薯和葛根等膳食纖維對油脂的吸附量[21]；對葡萄糖的吸附量為（1.40±0.62）mmol/g，高于豆渣、麥麩及玉米膳食纖維的吸附能力[15]；對亞硝酸鹽的吸附量為（50.39±0.37）μmol/g，優于已報道的大豆、魔芋、燕麥以及菠蘿膳食纖維[22-23]。結果表明，發酵法制備的藍莓果渣可溶性膳食纖維是一種優質的膳食纖維資源。

表4 膳食纖維特性分析Table 4 Character analysis of SDF

3 結論

本試驗以藍莓果渣為原料，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗獲得采用乳酸菌發酵法制備藍莓果渣可溶性膳食纖維的最佳工藝條件，即菌種的接種量12%、料液比 1 ∶6（g/mL）、發酵溫度 34 ℃、發酵時間48 h 以及pH 6.0；此條件下藍莓果渣可溶性膳食纖維的的率為15.92%，高于非發酵條件下的可溶性膳食纖維得率[24]，說明采用乳酸菌發酵可以明顯地提高可溶性膳食纖維的得率，并且發酵法得到的膳食纖維膨脹力、持水力以及對油脂、葡萄糖以及亞硝酸鹽的吸附能力均比原果渣有所提高，符合高質量膳食纖維的要求。本研究方法操作簡單，發酵時間短，成本低，為推動藍莓果渣資源的綜合利用提供了新的途徑，也為利用藍莓果渣膳食纖維開發保健食品的應用提供一定的理論依據。