響應面法優化羊肚菌褐色酸奶加工工藝研究

許俊齊，謝春芹，徐虔，凡軍民，張雪松

（江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院，江蘇鎮江212400）

酸奶營養豐富、風味獨特，可改善腸胃的菌群平衡，促進人體消化吸收，降低血液膽固醇，增強機體免疫能力，且酸甜可口，風味獨特，因此倍受人們青睞[1-2]。

近兩年內出現了一種新型褐色酸奶產品，與普通酸奶相比，此類酸奶最大的特點在于酸奶顏色為褐色，而非自然白色[3-5]。其原理是利用牛乳中的蛋白質與還原糖在高溫下發生美拉德反應而呈現褐色，美拉德反應賦予了酸奶獨特的色澤、滋味及口感，因此在色澤與風味上跟傳統酸奶有很大區別，又兼具獨特的焦糖風味和色澤[6-10]。

羊肚菌（Morchella）屬于珍稀食用菌品種，又名草笠竹，美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌、羊肚菜等。它的結構與盤菌相似，上部分呈褶皺網狀，既像蜂巢，也類似羊肚的模樣，因此而得名。羊肚菌除具有食用價值外，還具有很高的藥用價值。性平，味甘寒且無毒，具有益腸胃助消化、化痰理氣、補腎壯陽、提神補腦的功能，常被用來治療脾虛滑瀉、氣虛多痰、消化不良、體虛等癥狀[11-12]。

本試驗通過添加適量的羊肚菌汁，制備后的褐色酸奶顏色褐色適中，解決了牛乳經長時間高溫褐變后高糖發酵的發酵困難、發酵風味和組織狀態差等技術問題，產品焦香風味與發酵風味俱佳，組織狀態均勻細膩，且發酵時間較短、品質高，結合羊肚菌特殊功效，可適合各種人群食用，提高了褐色酸奶的市場需求和羊肚菌產業綜合效益。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

羊肚菌：產地為江蘇省句容市，由江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院食用菌教學工場提供；葡萄糖、鮮牛奶：市售；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）：河北一然生物科技有限公司；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：丹尼斯（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

JA2003 型電子天平：上海天平儀器廠；CH2176電磁爐：杭州九陽生活電器有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；LRH-150B 恒溫培養箱：天津市中環實驗電爐有限公司；SD-9011 色度計：上海圣科儀器設備有限公司；九陽C93T 料理機：杭州九陽生活電器有限公司；紗布、塑料杯、筷子：市售。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌褐色酸奶工藝流程

1.3.1.1 羊肚菌汁的制備

羊肚菌→挑選、清洗→打漿→均質→過濾→成品羊肚菌汁備用

1.3.1.2 羊肚菌褐色酸奶的制備

奶液+羊肚菌汁+糖進行調配→均質→褐變→冷卻→接種→灌裝→發酵→冷藏后熟→成品

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原料的選擇

選擇安全衛生市售的新鮮鮮牛奶為原料，85 ℃～90 ℃下殺菌處理 20 s～30 s。

1.3.2.2 羊肚菌汁的制備

將羊肚菌用45 ℃～50 ℃的溫水浸泡0.5 h。倒入體積比為 1 ∶3 水，順時針攪拌，反復清洗 2 次～3 次，撈出瀝干后，再將羊肚菌加2 倍水倒入打漿機進行打漿得菌汁，100 目篩網或雙層尼龍紗布過濾后得羊肚菌汁。

1.3.2.3 混合、均質

將一定比例的羊肚菌汁和適量葡萄糖倒入預熱至65 ℃～75 ℃的鮮牛奶中混合，調節均質壓力10 MPa～15 MPa，均質 5 min～10 min。

1.3.2.4 褐變

均質完成后，將溫度升至92 ℃～98 ℃，褐變90 min～150 min，進行褐變反應。

1.3.2.5 冷卻、接種

按5%～9%發酵劑（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1 ∶1）的添加量接種于冷卻至41 ℃～42 ℃的奶液中，充分攪拌均勻，放置恒溫培養箱發酵。

1.3.2.6 發酵、冷藏、后熟

將接種后的酸奶放入42 ℃恒溫培養箱進行發酵培養，5 h～7 h 后終止發酵，置于4 ℃冰箱冷藏后熟，以賦予酸奶良好的口感和風味，15 h 取出即為羊肚菌褐色酸奶成品。

1.3.3 羊肚菌褐色酸奶單因素試驗

本試驗對影響羊肚菌褐色酸奶的3 個主要因素：羊肚菌汁添加量、發酵時間、發酵劑的添加量分別進行研究。分別設置羊肚菌汁添加量9%、12%、15%、18%、21%；發酵時間 4、5、6、7、8 h；發酵劑的添加量4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%。采用單一變量控制法進行單因素試驗，考察各因素對羊肚菌褐色酸奶品質的影響，對成品進行感官評定。

1.3.4 羊肚菌褐色酸奶發酵工藝優化正交設計試驗

在單因素試驗的基礎上，選出羊肚菌添加量（A）、發酵時間（B）、發酵劑的添加量（C）3 個因素的較佳水平，進行正交試驗設計。以酸奶的感官評分為指標，選用L9（34）正交方法進行試驗。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計Table 1 Orthogonal test factors and horizontal design

1.3.5 羊肚菌褐色酸奶褐變工藝響應面設計試驗

根據單因素試驗結果，利用Box-Behnken 組合試驗設計原理，選擇褐變溫度、葡萄糖添加量、褐變時間3 個因素的較佳水平，進行響應面試驗設計。以感官評分為評價指標，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行處理，確定最佳的工藝條件。試驗因素和水平見表2。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Response surface test factor level table

1.4 指標測定方法

1.4.1 羊肚菌褐色酸奶的感官評價

根據GB19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》的有關要求及標準[13]，隨機選定20 人（男女各半）進行品嘗。用綜合評分法對產品進行感官評價，每人分別對各配方褐色酸奶進行評分，將每一組評分的平均值作為感官品嘗的指標。根據色澤、口感、氣味、組織狀態、酸甜度、整體感覺進行評分。采用百分制評分法，具體指標評分及各項權重參考表3 所示。

表3 羊肚菌褐色酸奶感官評分標準Table 3 The sensory scoring standard of brown yogurt of Morchella

1.4.2 美拉德反應程度測定方法

美拉德反應產物呈現黃褐色，是食品香味來源之一。使用SD-9011 色度計測量不同加熱條件下，褐色酸奶B 值（黃藍值）的反應的程度。測定指標中的B值，B 值越高，其正值越大，表示黃藍色越深，褐變反應越充分。美拉德反應越充分，即體現了褐色酸奶的濃郁焦糖風味[14]。

1.4.3 酸度的測定

按GB 5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》[15]測定酸度。

1.5 統計分析

試驗數據均采用minitab 數據處理系統和WPS2016 軟件進行正交數據分析及方差分析，采用Design-Expert 軟件進行響應面數據分析及方差分析。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌汁添加量對酸奶品質的影響

羊肚菌汁添加量對其酸奶感官評分及酸度的影響見圖1。

圖1 羊肚菌汁對酸奶品質的影響Fig.1 Effect of morel juice on the quality of yogurt of Morchella

由圖1 可知，當羊肚菌菌汁添加量為15%時，此時產品的感官評價最高及酸度保持在79.7°T，酸奶的酸甜適宜，伴有羊肚菌汁的清香。分析其原因可能為菌汁添加量較少時，只存在單一酸奶味道，而羊肚菌菌汁味較淡，無法產生混合后的特殊香味。反之，則亦然。因此，確定最佳菌汁添加量15%。

2.2 發酵時間對酸奶品質的影響

發酵時間對羊肚菌褐色酸奶品質的影響見圖2。

圖2 發酵時間對羊肚菌褐色酸奶品質的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of yogurt of Morchella

酸奶的發酵時間是影響酸奶成敗的關鍵因素，發酵時間較短，發酵不充分，產酸率較低，難以形成良好的凝乳狀且酸奶風味不佳。當發酵時間超過過長時，凝乳加快，酸甜比失調，影響其感官評分。由圖2 分析可知，羊肚菌褐色酸奶的感官隨著發酵時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，當發酵時間為6 h 時，產品感官評分最高，為85.3 分，酸度為77.8°T，此條件下褐色酸奶組織狀態較好，色澤均勻，口感爽滑，特征氣味濃郁，故確定最佳發酵時間為6 h。

2.3 發酵劑的添加量對酸奶品質的影響

發酵劑的添加量對羊肚菌褐色酸奶品質的影響見圖3。

圖3 發酵劑的添加量對羊肚菌褐色酸奶品質的影響Fig.3 Effect of additive amount of starter on the quality of morel brown yoghurt of Morchella

由圖3 可知，當發酵劑的添加量為6%時，口感滋味與酸奶的成型效果最好，感官評分達到最高為89分，酸度適中為78.8°T。當發酵劑添加量低于6%，產酸不足，酸奶無法凝固容易造成分層現象；當發酵劑添加量達到6%以上時，發酵快，風味不佳，影響酸奶的外觀及口感，感官評分較低。因此確定，最佳的發酵劑添加量為6%。

2.4 羊肚菌褐色酸奶工藝優化

2.4.1 正交試驗結果的極差分析

羊肚菌褐色酸奶生產工藝的正交試驗表見表4。

表4 羊肚菌褐色酸奶生產工藝的正交試驗Table 4 Orthogonal test of the process of morel brown yoghurt of Morchella

續表4 羊肚菌褐色酸奶生產工藝的正交試驗Continue table 4 Orthogonal test of the process of morel brown yoghurt of Morchella

由表4 分析可知，各單位因素對羊肚菌褐色酸奶品質影響的主次順序A＞C＞B＞D，即羊肚菌褐色酸奶菌汁添加量＞發酵劑的添加量＞發酵時間，羊肚菌褐色酸奶的最優配方為羊肚菌汁添加量15%，發酵時間6 h，發酵劑的添加量6%。經驗證，羊肚菌褐色酸奶的感官評分達 87.9±0.3。

2.4.2 正交試驗結果的方差分析

對試驗結果進行方差分析，表5 數據結果顯示，在本研究條件下，羊肚菌菌汁添加量影響極顯著（P＜0.01），發酵劑的添加量影響其感官分值顯著（0.01＜P＜0.05）。

表5 羊肚菌褐色酸奶工藝方差分析表Table 5 Analysis of variance analysis browning yogurt process of Morchella

2.5 羊肚菌褐色酸奶褐變條件響應面試驗

2.5.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果及Box-Behnken 中心組合設計原理，以褐變溫度（A）、褐變時間（B）、葡萄糖添加量（C）作為3 個因素，以感官評分為響應值，進行響應面優化試驗。試驗設計方案及數據結果如表6 所示，對表6 中數據進行方差分析，結果如表7。

表6 Box-Benhnken 設計方案及結果Table 6 Box-Benhnken design and results

采用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗結果進行多元回歸擬合，得出褐變溫度（A）、褐變時間（B）、葡萄糖添加量（C）與感官評價和黃藍值兩個響應值之間的二次回歸方程：

Y（感官評分）=+94.16-0.45×A+1.44×B+0.11×C+1.17×AB-1.42×AC-0.40×BC-3.11×A2-5.53×B2-4.58×C2

Y（黃藍值）=+12.56+0.11×A-0.050×B+0.61×C-0.10×AB-0.18×AC-0.15×BC-2.74×A2-2.67×B2-2.09×C2

回歸方程方差分析表見表7。

表7 回歸方程方差分析結果可知，感官評價模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項 P 值為 0.323 0 不顯著；黃藍值模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項P 值為0.444 8，說明試驗模型建立合理，試驗設計可行，多項回歸方程模型能準確反映褐變溫度、褐變時間及葡萄糖添加量對褐色酸奶感官評價及色度值的影響。此外，感官評價模型決定系數R2=0.974 4，調整決定系數R2Adj=0.941 4；黃藍值模型決定系數R2=0.996 6，調整決定系數R2Adj=0.992 3，說明模型擬合度較好，誤差較小，可以用于羊肚菌褐色酸奶工藝條件優化試驗的分析與預測。

表7 回歸方程方差分析表Table 7 Regression equation analysis of variance table

續表7 回歸方程方差分析表Continue table 7 Regression equation analysis of variance table

另外，從表7 回歸模型系數顯著性檢驗結果可以得出，羊肚菌褐色酸奶感官評價模型中一次項B 極顯著，A、C 項不顯著；二次項 A2、B2和 C2極顯著；交互項AB 顯著，其他交互項不顯著。羊肚菌褐色酸奶黃藍值模型中一次項C 極顯著，A、B 項不顯著；二次項 A2、B2和C2極顯著；交互項均不顯著。結果表明各影響因素對于感官評價和黃藍值的影響非簡單的線性關系。

2.5.2 因素間的交互作用

各因素之間的交互作用反應見圖4 和圖5。

圖4 各兩因素交互作用對感官評價影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of the interaction of two factors on sensory evaluation

響應曲面坡度越陡峭，說明響應值受到相應因素變化的影響較為顯著。由圖4 可知，各條件的交互作用顯著，響應曲面陡峭，與方法分析結果一致。從圖5可以看出，每組因素交互作用下，黃藍值有最大值。

2.5.3 配方的優化組合及驗證

圖5 各兩因素交互作用對黃藍值影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of two factors on the yellow-blue value

根據Box-Behnken 中心組合設計試驗結果進行二次多項式回歸方程計算，得到最佳配方為：褐變溫度控制為94.84 ℃，褐變時間控制為123.72 min，葡萄糖添加量控制為7.03%。為了方便生產操作，將褐變溫度修改為95 ℃，褐變時間為120 min，葡萄糖添加量為7%。與Design-Expert 8.0.6 得出的最優參數的評分預測值較為吻合，可見該試驗設計方法可靠有效。

3 結論

通過本試驗，研究了羊肚菌褐色酸奶的加工工藝，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗L9（34）的方法對羊肚菌褐色酸奶的加工工藝進行優化，考察了羊肚菌菌汁添加量、發酵時間及發酵劑對酸奶品質的影響。優化后得出最佳配方羊肚菌汁添加量為15%，發酵時間為6 h，發酵劑的添加量為6%，按此條件生產的褐色酸奶酸度為80.1°T，感官評分達最高值87.9±0.3，且產品組織狀態良好，口感風味良好，焦糖風味突出。按照Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，分別以感官評價和黃藍值為響應值，設計三因素三水平響應面試驗設計，進行優化。方差分析發現模型顯著（P＜0.05），準確度和精密度均較高，響應曲面分析研究了各因素交互作用對響應值的影響。最終通過回歸方程得出了羊肚菌褐色酸奶的最佳發酵工藝條件為葡萄糖添加量為7%，褐變溫度95 ℃、褐變時間120 min。在此條件下的驗證試驗中羊肚菌褐色酸奶的平均感官評分94.16，平均黃藍值為12.6，與預測值基本一致。此時的羊肚菌褐色酸奶呈現褐色，焦糖風味與酸奶味結合，口感細膩順滑，具有廣闊的市場前景。