參苓白術散對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病大鼠Kupffer細胞mTORC1/STAT3信號通路的影響※

黃裕華 徐擁建 馮高飛 黃柏強 楊 英 鄧遠軍

[北京中醫藥大學深圳醫院(龍崗)肝病科，廣東 深圳 518172]

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損傷致病因素，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪性樣變為主要特征的一組臨床病理綜合征。現代醫學認為，NAFLD是一種導致機體能量穩態失衡的遺傳、環境、代謝應激相關性肝病，是代謝綜合征在肝臟的表現，包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及由其引起的肝纖維化、肝硬化。NAFLD發病機制復雜，至今未完全闡明，據相關研究報道，可能與脂質代謝障礙、胰島素抵抗(IR)、攝入過量果糖、脂肪組織功能紊亂，腸道菌群失調導致炎癥、氧化應激、內質網應激有關[1-3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內的中心信號調控分子，其對細胞生長周期進程、蛋白質合成及降解、膜蛋白的轉運、蛋白激酶信號轉導等起到至關重要的作用。細胞轉導子和轉錄活化子3(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)作為細胞轉導子和轉錄活化子家族(STATs)的一員，與肝臟關系最密切，在被激活后可轉位進入細胞核內，并與脫氧核糖核酸(DNA)結合，啟動下游基因表達，促進脂質蓄積，并產生局灶性炎性微環境，維持細胞功能，調控細胞生長[4]。本實驗通過觀察參苓白術散對NAFLD大鼠肝Kupffer細胞mTOR復合物1(mTORC1)/STAT3信號通路相關基因及蛋白表達的影響，探討其對NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康成年雄性SD大鼠80只，8周齡，體質量(200±20) g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物合格證號：SCXK(魯)20140007。大鼠飼養于SPF級動物實驗室內，溫度為22～26 ℃，濕度為45%～55%，明暗各12 h，自由進水進食。

1.1.2 實驗藥物 參苓白術散[5]藥物組成：人參15 g，白術15 g，茯苓15 g，砂仁6 g，山藥15 g，白扁豆12 g，薏苡仁9 g，桔梗6 g，蓮子9 g，炙甘草9 g。方中藥材均為華潤三九醫藥股份有限公司生產的免煎單味中藥配方顆粒劑。按上述中藥配方顆粒劑相當于藥材飲片的劑量，換算成實驗室所需飲片劑量，溶于水，調勻制成混懸液備用。高脂飼料由基礎飼料(88.0%)、豬油(10.0%)、膽固醇(1.5%)、Ⅲ號膽鹽(0.5%)組成。

1.1.3 實驗儀器及試劑 全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；Epoch酶標儀(美國Bio-Tek公司)；流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；微量核酸分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；雙通道通用型注射泵(KDS200型，美國KD Scientific公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real time-PCR)儀(美國BIO-RAD公司)；TRizol裂解液、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)；mTORC1-抗體(mTORC1-Antibody)、STAT3-抗體(STAT3-Antibody)(美國Cell Signaling Technology公司)；RIPA裂解液(北京雷根生物技術有限公司)；兔抗大鼠溶菌酶抗體(Anti-Lysozyme)(上海依科賽生物制品有限公司)；過氧化物酶(HRP)羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體(廣州雅怡生物科技有限公司)；Ⅳ型膠原酶(美國GIBCO公司)；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和IL-5、IL-6酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；3%戊巴比妥鈉溶液、10%多聚甲醛溶液(上海銘博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將80只SD大鼠適應性喂養1周后，按照隨機數字表法分為4組，空白組、模型組及參苓白術散低、高劑量組，每組20只。

1.2.2 模型制備 空白組大鼠予基礎飼料喂養，其余3組均予高脂飼料喂養制備NAFLD模型[6]。同時參苓白術散低、高劑量組均按10 mL/kg給予相應劑量參苓白術散灌胃，每日1次，連續8周。每只大鼠的具體給藥劑量按動物體型系數換算法折算[7]，參苓白術散低劑量組為人臨床等效劑量(含生藥量1.0 g/mL)，參苓白術散高劑量組為人臨床等效劑量的3倍用量(含生藥量3.0 g/mL)。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 一般情況 實驗期間觀察各組大鼠體態毛色、行為能力、食欲、大小便及對外界刺激的反應情況。

1.3.2 肝組織病理學觀察 在第8周末次給藥后，經禁食不禁水12 h后，各組隨機選取10只大鼠，予3%戊巴比妥鈉溶液1 mL/kg腹腔注射麻醉，經腹主動脈采血后處死，取大鼠肝組織保存備用。在肝右葉相同區域取1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm的小塊組織，為避免脂滴降解，務必于當日行冰凍切片，厚約6 μm，油紅O脂肪染色法后，400倍光鏡下觀察肝組織內脂滴分布及病理組織學變化。另取若干小塊肝組織以10%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，做4 μm切片，行蘇木素—伊紅(HE)染色，中性樹脂封固，200倍光鏡下觀察大鼠肝組織脂肪變性程度。

1.3.3 Kupffer細胞分離與鑒定 余下每組10只大鼠用以提取原代肝Kupffer細胞[6，8-10]，Kupffer細胞純度達90%以上。

從當前道路運輸安全管理實際來說，隨著管理工作量的不斷增加，若想保證安全管理工作高質量落實，必須要創新管理方式。在具體實踐中，要積極引入信息技術和大數據技術等，輔助安全監管工作的開展。比如，利用大數據技術，分析安全事故高發路段，加大安全檢查部署，做好事前預防工作。再比如，通過在客運車輛中設置遠程監控系統和超速報警裝置等，實現運輸環節的安全監督，進而減少安全事故的發生。

1.3.4 血脂指標及Kupffer細胞炎癥因子檢測 經腹主動脈取血，存于無抗凝添加劑的采血管內，采用全自動生化分析儀檢測血脂指標總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。采用Epoch酶標儀檢測Kupffer細胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.3.5 Real time-PCR檢測 Kupffer細胞mTORC1、STAT3 mRNA表達取培養的貼壁Kupffer細胞，經4 ℃，12 000 r/min，離心8 min，棄上清液，加入TRizol裂解液1 mL裂解Kupffer細胞，提取總RNA，用微量核酸分光光度計檢測總RNA濃度，按照Quant cDNA第一鏈合成試劑盒說明，逆轉錄為cDNA。取反轉錄產物進行Real time-PCR反應。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計及合成，選用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參基因。mTORC1：上游引物：5'-CAGAGGGCAGCAACAGTGAAAG-3'，下游引物：5'-GACAAGGAGATAGAACGGAAGAAGC-3'，片段長度：134 bp；STAT3：上游引物：5'-ACCAGCAGTAT-AGCCGCTTC-3'，下游引物：5'-GCCACAATC-CGGGCAATCT-3'，片段長度：97 bp；GAPDH：上游引物：5'-GATCCCGCTAACATCAAATG-3'，下游引物：5-'GAGGGAGTTGTCATATTTCTC-3'，片段長度：96 bp。按照說明書在冰臺上配置20 μL反應液，反應條件為95 ℃持續30 s預變性；95 ℃持續10 s變性；mTORC1、STAT3、GAPDH 60 ℃退火30 s；60 ℃延伸40 s，擴增39個循環；再于70～90 ℃，持續5 s，分析溶解曲線。用Opticon Monitor 3.1軟件整理和分析。設定空白組基因表達水平為1。公式：2-△△Ct=實驗項目的基因表達相對于空白組的變化倍數。△△Ct=實驗組(Ct目的基因-Ct內參基因)-空白組(Ct目的基因-Ct內參基因)。計算各組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3 mRNA表達量。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測Kupffer細胞mTORC1、STAT3蛋白表達 每RIPA裂解液1 mL加入5×106個Kupffer細胞，吹打均勻，14 000 r/min，4 ℃下離心8 min。為避免蛋白降解，在冰臺上，取上清液二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，對樣品上樣量的終濃度調整為50～80 μg/μL。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)法電泳分離蛋白，濕轉膜法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，加入含5%脫脂奶粉封閉液，常溫下平搖1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜后，加入提前配制好的一抗稀釋液(mTORC1 1∶5 000稀釋；STAT3 1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜孵育后，再次PBS洗膜除去過量的一抗稀釋液，加二抗稀釋液(HRP羊抗兔IgG抗體)(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜后，進行化學發光反應。用Quantity One軟件分析GAPDH與目的蛋白mTORC1、STAT3的光密度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 空白組大鼠體型適中，皮毛光亮，動作靈活，反應敏捷。模型組大鼠體型肥胖，皮毛枯黃，動作遲鈍，鼠籠敷料潮濕，飲水量多，大便溏軟，易激惹咬噬。參苓白術散低、高劑量組大鼠精神狀態、體型、毛發光澤度、行為反應性、排泄物等情況介于正常組與模型組大鼠之間。其中參苓白術散高劑量大鼠體型普遍較小于參苓白術散低劑量組，在精神狀態、毛發光澤度、行為反應方面也優于參苓白術散低劑量組。

2.2 各組大鼠肝組織病理學觀察

2.2.1 油紅O脂肪染色 空白組細胞核藍染，染色后細胞漿中紅色油滴不明顯。模型組藍染的細胞核若隱若現于細胞中，染色后，胞質中可見大量紅色油滴，部分融合。參苓白術散低、高劑量組肝組織染色脂滴紅染面積及程度較模型組明顯縮小和減輕，參苓白術散高劑量組肝組織形態最接近空白組。見封3，圖1。

2.2.2 HE染色 空白組細胞核藍染，核大而圓，居中，胞漿均勻紅染，胞內無脂肪空泡，肝索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，結構清晰，排列規則，未見炎癥細胞浸潤或壞死灶。模型組肝細胞腫脹或膨大，呈氣球樣變，細胞核被脂肪空泡擠壓于一側，肝竇、肝索結構排列紊亂，肝竇受壓變窄，匯管區可見大量炎癥細胞浸潤，視野內有散在的點狀壞死灶。參苓白術散低、高劑量組在肝細胞形態、肝索排列、氣球樣變、炎癥細胞浸潤及點狀壞死灶方面，較模型組有不同程度改善，其中參苓白術散高劑量組肝組織病理學變化改善最顯著。見封3，圖2。

組 別nTCTG空白組102.06±0.300.73±0.11模型組104.50±0.60?1.21±0.16?參苓白術散低劑量組103.53±0.94△1.07±0.10△參苓白術散高劑量組102.48±0.84△#0.96±0.13△#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與參苓白術散低劑量組比較，#P<0.05

由表1可見，模型組大鼠TC、TG較空白組升高(P<0.05)，說明造模成功。參苓白術散低、高劑量組大鼠TC、TG較模型組降低(P<0.05)，說明治療有效，參苓白術散高劑量組較參苓白術散低劑量組降低更明顯(P<0.05)。

2.4 各組大鼠Kupffer細胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6比較 見表2。

組 別nTNF-αIL-1βIL-5IL-6空白組1097.87±14.1573.27±27.31102.53±16.4098.45±18.36模型組10351.74±21.72?177.76±21.33?251.30±24.61?260.77±19.33?參苓白術散低劑量組10187.89±20.59△112.99±13.75△163.23±21.69△187.09±23.90△參苓白術散高劑量組10143.85±14.09△#100.77±20.97△#147.85±16.36△#113.58±15.56△#

與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與參苓白術散低劑量組比較，#P<0.05

由表2可見，模型組大鼠Kupffer細胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6均較空白組升高(P<0.05)；參苓白術散低、高劑量組大鼠Kupffer細胞TNF-α、IL-1β、IL-5及IL-6均較模型組降低(P<0.05)，說明治療有效，參苓白術散高劑量組較參苓白術散低劑量組降低更明顯(P<0.05)。

2.5 各組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3 mRNA表達比較 見表3。

組 別nmTORC1 mRNASTAT3 mRNA空白組101.11±0.901.08±0.59模型組105.54±1.17?3.39±1.01?參苓白術散低劑量組104.12±1.21△2.66±0.94△參苓白術散高劑量組102.05±1.06△#1.75±0.88△#

與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與參苓白術散低劑量組比較，#P<0.05

由表3可見，模型組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3 mRNA表達均較空白組升高(P<0.05)；參苓白術散低、高劑量組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3 mRNA表達均較模型組降低(P<0.05)，參苓白術散高劑量組較參苓白術散低劑量組降低更明顯(P<0.05)。

2.6 各組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3蛋白表達比較 見表4、圖3。

組 別nmTORC1蛋白STAT3蛋白空白組100.61±0.090.57±0.06模型組101.71±0.13?1.03±0.10?參苓白術散低劑量組101.42±0.10△0.93±0.07△參苓白術散高劑量組101.22±0.10△#0.85±0.06△#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與參苓白術散低劑量組比較，#P<0.05

由表4可見，模型組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3蛋白表達均較空白組升高(P<0.05)；參苓白術散低、高劑量組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3蛋白表達均較模型組降低(P<0.05)，且參苓白術散高劑量組較參苓白術散低劑量組降低更明顯(P<0.05)。

A空白組；B模型組；C參苓白術散低劑量組；D參苓白術散高劑量組

圖3 各組大鼠Kupffer細胞mTORC1、STAT3蛋白表達

3 討 論

近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的變化，NAFLD發病率呈上升趨勢，發病年齡也日趨年輕[11]。此類人群的生活習慣若不改變及得不到有效藥物的治療，后期可發展為肝硬化、肝癌[12-13]。肝臟Kupffer細胞位于肝血竇內，是人體內最大的固定巨噬細胞群，約占肝臟所有細胞總數的15%，占全身巨噬細胞總數的80%～90%[14]。Kupffer細胞具有吞噬微生物、清除內毒素、攝取抗原并激發獲得性免疫的作用，它還能釋放過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)，將中性粒細胞和淋巴細胞等炎性反應細胞聚集在肝內，并釋放炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等[15-16]，引起肝臟炎性反應。

mTOR是一種非典型絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要通過與不同的適配子結合形成2種主要復合物：mTORC1和mTORC2。目前對mTORC1的研究更為深入，其在調節脂質代謝中發揮重要作用[17]。當mTOR被激活時，其復合物可通過促進脂肪及關閉分解代謝過程(如脂肪分解和β-氧化)來促進TG的積累，進而促進細胞內脂質含量增加[18-19]。研究證實，高脂飲食是NAFLD發病的重要誘導因素，攝入過高的脂肪可使mTOR通路處于持續激活狀態，導致mTORC1合成增加，促進肝臟炎癥發生[20]。NAFLD大鼠mTORC1和TNF-α、IL-6、IL-5及IL-1β均處于高水平表達或分泌[21-23]，可見mTORC1是炎癥發生的關鍵靶向分子蛋白。

STAT3作為重要的轉錄因子，亦參與肝臟脂質代謝，其在脂肪肝中激活顯著升高[24]。同時STAT3作為形成肝臟炎性微環境的重要炎癥介質，其調控炎性反應的機制日益受到醫學研究的重視[25-26]。研究表明，STAT3的異常表達及活化導致炎癥微環境的形成，促進了脂質積累，是發生NAFLD的關鍵因素[27]。Hye-Young Seo等[28]研究發現，在由脂多糖(LPS)誘導形成的NAFLD大鼠模型的肝組織中，炎癥病灶STAT3高表達，同時伴有IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌量增加，使用咖啡豆醇可抑制STAT3的活化，進而降低IL-6、TNF-α、和IL-1β的分泌，緩解NAFLD大鼠肝臟的炎性反應。Fredholm S[29]研究表明，STAT3的高表達促進了IL-5的分泌。此外，mTOR與STAT3關系密切，mTOR可抑制核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路，促進STAT3的活化[30]，兩者相互作用以控制和優化免疫反應[31]。因此，選擇適當的藥物阻斷mTORC1、STAT3靶點，抑制TNF-α、IL-1β、IL-5和IL-6分泌，對防治NAFLD意義重大。

中醫學無NAFLD這一病名，將其歸為脅痛、肝著、肝癖等范疇。中華中醫藥學會脾胃病分會在《非酒精性脂肪性肝病中醫診療專家共識意見(2017)》中指出，NAFLD病因主要有飲食失衡、勞逸失度、情志不節等，病機以脾腎虧虛為主，主要病理因素是痰、濕、濁、瘀，在分期論治中，初期疏肝理氣、健脾和胃，中后期健脾益腎、化瘀散結，可見脾虛失運是關鍵病機之一，健脾法貫穿始終[32-33]。參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，方中人參大補脾胃，白術、茯苓健脾滲濕，共為君藥。山藥、蓮子二藥助人參、白術健補中州，厚腸止瀉；白扁豆、薏苡仁既能健脾，又可滲濕，此四藥共為臣藥。佐以砂仁芳香醒脾行氣，暢達中焦氣機；桔梗宣通上焦肺氣，通利水道，有助健脾除濕之力。炙甘草和中，調和諸藥，為使藥。全方具有健脾、益氣、滲濕功效。

本研究結果提示，模型組大鼠肝臟脂質蓄積及脂肪變性，存在嚴重的脂質代謝紊亂，Kupffer細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-5含量升高，mTORC1、STAT3 mRNA及蛋白表達上調。不同劑量參苓白術散干預后，大鼠脂質代謝及炎性反應有不同程度的減輕，mTORC1和STAT3 mRNA及蛋白表達下調，其中以參苓白術散高劑量組效果較為顯著，說明參苓白術散改善肝臟脂肪沉積及炎性反應可能與劑量有一定的相關性。

綜上所述，參苓白術散防治NAFLD，可能與抑制mTORC1、STAT3 mRNA及蛋白表達，減少炎癥介質產生，改善肝細胞變性程度有關。