諾卡沙星及其結構類似物的研究進展

董志珅，倪孟祥

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210000)

近幾十年來，由于抗生素的大量使用，導致細菌變異出大量耐藥菌，嚴重威脅人類健康。在美國，每年有至少200萬人感染耐藥菌，2.3萬人死于耐藥菌感染[1]。我國是一個人口大國，耐藥菌對我國人民生命健康的威脅絲毫不亞于癌癥，解決好耐藥菌的問題刻不容緩。因此，研究抗菌新機制、開發新的臨床藥物尤為重要。

諾卡沙星是由百時美施貴寶公司的Leet等[2]于20世紀末發現的，其從一發現便引起全球的廣泛關注，其中不乏制藥巨頭，不過大部分的研究集中在21世紀的前10年，而最近10年對其關注熱點急劇下降。制藥巨頭放棄諾卡沙星的主要原因可能是因為諾卡沙星的成藥性差，投入與回報不成比例。圖1是以“Nocathiacin”為詞條在百鏈數據庫檢索到的期刊文獻及專利數量。

圖1 以“Nocathiacin”為詞條在百鏈數據庫檢索到的期刊文獻及專利數量Fig.1 Number of journal documents and patents retrieved by "Nocathiacin" in Bailian Database

與常規抗生素相比，諾卡沙星是一類比較少見的硫肽類抗生素家族，雖然該家族中已經有100多種分子為我們所知[3]，但是真正研究透徹、實現商品上市的并不多，現在市場上常用產品有硫鏈絲菌素、那西肽等。

作者在此從時間維度上綜述諾卡沙星及其結構類似物的生物合成機制、生產策略、抗菌機制，指出諾卡沙星及其結構類似物在應用方面存在的問題，為其在醫藥及養殖行業的廣泛應用提供有效策略。

1 諾卡沙星及其結構類似物

諾卡沙星是由三噻唑取代吡啶為核心的環肽類抗生素，其結構類似物是具有相同核心、對氨基酸肽鏈進行結構改造以及對側鏈進行修飾得到的。諾卡沙星及其結構類似物大多是由苛求擬無枝酸菌(Amycolotopsisifastidiosa)以及假諾卡氏菌(Nocardiapseudobrasiliensisi)發酵產生的天然次級代謝產物。目前，諾卡沙星有NocathiacinⅠ、Nocathiacin Ⅱ、Nocathiacin Ⅲ、Nocathiacin Ⅳ等4種，NocathiacinⅠ的結構式[4]如圖2所示。

噻唑霉素的結構特征和諾卡沙星極其相似，只是側鏈的相關官能團發生了改變[5]，如圖3所示。目前，約有10種天然的噻唑霉素分子，其中有幾個分子是缺少吲哚環的，它們在生物代謝上被證明是諾卡沙星和噻唑霉素的前體。

2 諾卡沙星及其結構類似物的生物合成機制

2.1 核糖體蛋白的基因表達

起初學者們并不能確定諾卡沙星及其結構類似物的先導肽是核糖體蛋白還是非核糖體蛋白，甚至對整個硫肽類抗生素家族的來源都模棱兩可。直到2009年，結合各項研究成果最終得到結論，諾卡沙星及其結構類似物是一種核糖體蛋白。2011年，劉文團隊成功克隆了硫鏈絲菌素生物合成基因簇，闡明了碳端合成機制[6]。Luo等[7]通過位點突變和探針的插入證明了硫肽生物合成基因簇的正確性。TclE-h基因是編碼先導肽鏈骨架的基因，在該基因的上游編碼了雙加氧酶基因TclD，下游則編碼了多個功能酶以及外排泵的基因。此外，在該基因鏈中還含有編碼了核糖體L11蛋白的基因以及菌體本身的抗性基因。陳依軍團隊[8]深入研究了那西肽生物合成基因簇，確定了那西肽生物合成過程中的轉錄因子，同樣證明了那西肽也是由核糖體蛋白表達產生的。

圖2 NocathiacinⅠ的化學結構式Fig.2 Chemical structural formula of Nocathiacin Ⅰ

圖3 噻唑霉素的化學結構式Fig.3 Chemical structural formula of Thiazomycin

2.2 先導肽鏈的切除

骨架基因TclE-h表達的先導肽鏈氨基酸殘基一般有50～60個，隨后會在水解酶的作用下切除N末端的30多個殘基，剩下的十幾個殘基的N端第一個氨基酸是絲氨酸，第二個是半胱氨酸。在肽鏈的結構中也存在“半胱氨酸-絲氨酸-半胱氨酸”的三連結構，該結構序列是形成噻唑環、吡啶環的核心殘基序列。

2.3 噻唑環、吡啶環的形成

噻唑環是由絲氨酸和蘇氨酸殘基脫水形成的(圖4a)，而吡啶環則是在肽鏈充分彎曲的情況下，兩個半胱氨酸在酶的作用下縮合氧化形成的(圖4b)。這種結構在諾卡沙星和噻唑霉素中都是一樣的。

a.噻唑環形成的化學過程 b.吡啶環形成的化學過程

2.4 基團的修飾

在經過噻唑環、吡啶環及骨架形成過程后，便得到噻唑霉素的前體物噻唑霉素E，對其基團進行不同修飾即可得到噻唑霉素E1、噻唑霉素E2、噻唑霉素E3[5]。通過控制培養條件對側位基團進行修飾，不同的培養條件會形成不同的基團修飾，所以才會形成諸多的諾卡沙星類似物。為得到高純度藥品，往往需要經過多次條件優化。除此以外，在環肽形成以后，鏈中蘇氨酸的一個側鏈羥基會和吲哚反應，給分子結合上一個吲哚，這便形成了諾卡沙星和噻唑霉素的本體。

3 諾卡沙星及其結構類似物的生產策略

諾卡沙星是由放線菌分泌的一種體外天然抗生素。由于其結構復雜，化學全合成策略到目前為止還沒有實現。但是隨著化學合成技術的進步，發展了一些半合成化學工藝。雖然不能完全合成出諾卡沙星，但是半合成的思路為諾卡沙星的結構改造提供了相應的策略。

3.1 生物發酵

在自然條件下，諾卡沙星產生菌的野生菌株分泌量很低，遠達不到需求量。經過定向誘變菌株和優化培養條件后，諾卡沙星產生菌的發酵水平可以達到300 μg·mL-1[4]。作者所在課題組通過物理誘變，獲得一株可以穩定產諾卡沙星的苛求擬無枝酸菌，同時優化了發酵培養基及發酵條件。發酵培養基組成為：葡萄糖30 g·L-1、酵母提取物15 g·L-1、硫酸銨2 g·L-1、磷酸氫二鉀3 g·L-1、豆粉20 g·L-1。在32 ℃、200 r·min-1的搖床中培養72 h，諾卡沙星產量可達230 mg·L-1、純度可達80%以上。在相同條件下，噻唑霉素的產量始終很低，可以忽略不計。

那西肽目前已經上市，它的主要生產手段就是通過活躍鏈霉菌進行發酵，其產量已經達到克級，通過不斷的育種篩選可以得到優良菌株。李依韋等[9]通過育種篩選得到了一株產量高達1 582.73 μg·mL-1的高產菌株。

3.2 化學半合成

諾卡沙星及其結構類似物是由核糖體前體蛋白修飾而成的，而核糖體蛋白都服從中心法則，所以在諾卡沙星的改造中可以通過突變的方式改變骨架基因的編碼，形成新的骨架。通過大量的非定點突變可以形成諾卡沙星及其結構類似物的分子庫。該策略已經大量應用于其它的硫肽類抗生素上[10-12]。

利用化學半合成方法改造諾卡沙星的策略主要有兩個：第一，不改變主體骨架，只對末端結構進行改造，在諾卡沙星的末端有脫水丙氨酸(dehydroalanine)，由于其空間位阻小，提供了改造的可能性，不僅可以引入親水基團增加水溶性，為成藥做鋪墊，還可以降解掉末端官能團，形成新的化合物[13]。第二，對骨架進行相應的改造，有報道對大環骨架上的2-羥基吡啶[14]以及N-羥基吲哚[15]進行相應的定向衍生，優化了諾卡沙星分子，在保留其抗菌活性的同時，增加溶解度。

4 諾卡沙星及其結構類似物的抗菌機制

諾卡沙星的抗菌機制從時間上來看并不是非常新穎。早在1979年，Wienen等[16]在研究硫鏈絲菌素對細菌作用后蛋白質的變化時發現，硫鏈絲菌素是通過結合核糖體L11蛋白、阻斷蛋白質合成途徑來起到抑制細菌生長的作用。目前，臨床上還沒有明確發現該途徑的高致病性耐藥菌。

5 諾卡沙星及其結構類似物在應用方面存在的問題

(1)溶解性差

97%純度的諾卡沙星是淡黃色偏綠的干燥粉末，有強烈的揮發性香氣，分子極性低，溶解性差。在水中的溶解度低于1 mg·mL-1，在純甲醇和乙酸乙酯中的溶解度低于10 mg·mL-1；易溶于氯仿、二甲亞砜等低極性試劑。溶解性差是諾卡沙星的主要問題，在幾乎所有的相關文獻中，都有相同的表述。

(2)見光易分解

諾卡沙星分子物理穩定性很差，在紫外光照射下極易降解，半衰期約為3 h。所以其儲存條件比較苛刻，生產工藝要求也很高。

(3)對細胞有毒殺作用

諾卡沙星的作用途徑是蛋白質合成途徑，那么勢必在一定劑量下會對人體細胞產生毒殺作用。作者所在課題組通過體外細胞實驗，驗證了低劑量條件下諾卡沙星對HepG2細胞株的毒殺作用，結果顯示，在劑量低于1 μg·mL-1時，諾卡沙星對HepG2細胞株沒有統計學上的細胞毒殺作用；在劑量高于10 μg·mL-1時，存在統計學上的細胞毒殺作用。

(4)成本高

目前，諾卡沙星及其結構類似物大多還是由發酵產生的，也正是因為溶解性的問題，導致發酵產量一直不高，達不到工業大生產的水平，即使實驗室小試的生產成本也高達數百元。這么高的生產成本，是否能被市場接受，也是一個巨大的挑戰。

(5)純化步驟復雜

諾卡沙星及其結構類似物目前的生產方法決定了后續的純化工藝的復雜性。雖然實驗室階段已經可以生產出60%～70%純度的產品，但在制藥行業，這種純度遠沒有達到要求。目前的純化策略主要是溶媒萃取法獲得粗品，然后根據分子性質差異設計后續的分離工藝，主要有凝膠柱分離法、ODS柱分離法、薄層制備板分離法以及大孔樹脂分離法。實驗室通過凝膠柱分離以及薄層板分離粗品，得到97%純度的諾卡沙星，但回收率太低，也不適合大批量生產。徐天華等[17]對那西肽的純化工藝進行了研究，比較了8種大孔吸附樹脂對那西肽粗品所含雜質的吸附能力，發現混合樹脂純化那西肽比較理想，可以得到99%純度的那西肽。該工藝可以純化克級甚至十克級樣品，如果對其進行改進，也可能實現大量純化的設想。

6 諾卡沙星及其結構類似物的應用

諾卡沙星及其結構類似物即便有一些缺點，但并不妨礙它的廣泛應用。1998年，農業部批準了那西肽作為新獸藥；硫鏈絲菌素也被廣泛應用于獸用飼料添加劑。雖然目前還沒有供人直接使用的產品上市，但是從目前的研究來看，應用是可期的。

6.1 醫藥行業的應用

諾卡沙星及其結構類似物在臨床上可以制備成注射粉針制劑[18]，與其它藥物聯合使用，治療感染高危病患。根據體外數據顯示，諾卡沙星和噻唑霉素的最低抑菌濃度(MIC)為3 ng·mL-1[6]。這表明諾卡沙星的抑菌效果非常好。

諾卡沙星及其結構類似物還有潛在的抗癌作用，由于其作用途徑為蛋白質合成途徑，理論上對癌細胞是具有毒殺作用的，并且已經有報道稱，硫鏈絲菌素可以誘導非小細胞肺癌細胞自噬，可以作為臨床上針對非小細胞肺癌的自噬誘導劑[19]。

6.2 養殖行業的應用

諾卡沙星及其結構類似物可以用于食品工業。近年來，我國政府發布大量政策及意見指導：在肉類及禽類養殖加工中，慎重使用抗生素。在這種情況下，為了保證生產，類似于那西肽等新型的抗菌藥物被廣泛應用于農業，幫助從業者用藥作業的同時，也保護了消費者的食品安全權益。那西肽和硫鏈絲菌素已經在這方面完成了實踐，有相應的獸用產品上市，諾卡沙星也可以往這方面拓展。

7 展望

臨床耐藥菌對人類健康的威脅日趨嚴峻，新抗生素的研發難度越來越大，近年新獲批的抗生素種類越來越少。這種現狀的存在具有兩面性：一方面，減少抗生素的使用，有利于耐藥菌的野生化；另一方面，一旦爆發大規模疫情，可能會無藥可用，這種風險是存在的。諾卡沙星及其結構類似物有極佳的抑菌活性，雖然成藥性差，目前無法直接應用于臨床。但是隨著化學合成技術的更新、制藥技術的進步，這些問題必會解決。相信，不久的將來，諾卡沙星及其結構類似物可以成為臨床藥物，為人們的健康服務。