外源碳源對葡萄酵素微生物生長代謝及生物活性的調節作用

劉毓鋒,曾嘉銳,黃文琪,2,吳振強,*

(1.華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006;2.江門市泛亞生物工程與健康研究院,廣東江門 529000)

酵素是以果蔬汁等為原料,經微生物發酵釋放或產生更易消化的有機物質的混合發酵液[1]。果蔬酵素富含SOD酶、乳酸、乙酸及少量乙醇等代謝物和多酚、黃酮等活性物質,具有抗氧化、防衰老、抑菌、增強免疫、促進新陳代謝等生理功能[2-3]。果蔬酵素的發酵工藝有純種發酵與自然發酵,其中純種發酵需要對果蔬原料進行滅菌處理,會造成營養、風味的破壞;而自然發酵是通過原料本身攜帶的酵母菌等微生物進行發酵,未對原料本身進行高溫滅菌處理,能有效保留原料中本身具有的活性物質,發酵微生物主要有酵母菌、乳酸菌等益生菌及曲霉[4]。傳統生產酵素多偏向于采用自然發酵工藝進行[5]。如張夢梅等[6]研究表明不同原料果蔬酵素自然發酵過程中廣泛存在酵母菌與乳酸菌;陳英等[7]報道果蔬酵素發酵過程中酵母菌、乳酸菌互利共生,促進轉化生成酯類、酸類等,賦予發酵產品獨特的風味及口感。酵素自然發酵的研究熱點多集中在提高抗氧化性能等功能作用[8-9]。其中,郭艷萍等[10]研究表明葡萄酵素自然發酵可使其抗氧化能力提高;劉維兵等[11]發酵葡萄海棠果酵素,表明酵素產品具有一定的抑菌性和抗氧化活性。酵素產品添加外源碳源發酵,可提高發酵產品的營養價值及功效作用。如蔣增良等[12]按葡萄與紅糖質量比1∶1自然發酵釀制葡萄酵素,發酵后總酸含量、抗氧化能力提高,有機酸以酒石酸、乙酸、檸檬酸為主,較強的自由基清除能力與有機酸、多酚、SOD酶等相關;楊小幸等[5]按蘋果與白糖質量比2∶1自然發酵,發酵后乳酸、乙酸等有機酸含量提高;洪厚勝等[13]添加糖蜜制備葡萄果渣酵素,表明酵母菌在厭氧條件下產生乙醇,乳酸菌代謝產生乳酸、乙酸,豐富了有機酸種類;張艷明等[14]釀制葡萄牛蒡酵素,結果表明添加30%白糖糖化牛蒡,使酵素口感更為醇厚;李騰宇等[15]以紅糖為原料釀造紅糖醋,發酵后乙酸含量增加,多酚、黃酮含量與抗氧化能力正相關;張旭普等[16-17]添加蜂蜜進行糙米酵素發酵,經發酵優化后酵素口感及營養價值得到改善。近來,因紅糖相比其它精制糖,更富含礦物質及維生素、有機酸等營養物質,其消費熱度逐漸提高并廣泛用于食品及飲料加工等方面[18-19]。

多數酵素產品添加較高濃度的外源碳源進行發酵,但在外源碳源對微生物生長代謝的相關報道較少,主要功效及功能成分缺乏對應標準,使國內果蔬發酵產品質量難于評判[20]。本文以葡萄為原料,添加外源碳源,包括紅糖、白糖或蜂蜜等進行自然發酵,探究發酵過程中酵母菌和乳酸菌生長,以及SOD酶活、總酸含量、有機酸、pH、抗氧化活性等理化特性的變化趨勢,尋找適于葡萄酵素釀制的外源碳源,為天然酵素產品的綜合開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏黑葡萄(新鮮,無腐爛,無霉變,大小、重量均勻) 市售;紅糖 廣州太古糖業有限公司;白糖(白砂糖) 廣州福正東海食品有限公司;蜂蜜 上海冠生園(集團)有限公司;有機酸標準品(純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;果膠酶(10000 U/g) 南寧東恒華道生物科技有限公司;磷酸(色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;甲醇(色譜純) 北京邁瑞達科技有限公司;DPPH(≥99%)、ABTS(≥99%) 美國Sigma-Aldrich公司;其余試劑 均為國產分析純。

JYL-C022E榨汁機 濟南九陽股份有限公司;MP502B電子天平 上海精密實驗器材有限公司;SW-CK-1F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;LRH-150B生化培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司;PB-10型pH計 賽多利斯科學儀器有限公司;LB62T折光儀 廣州速為電子科技有限公司;SpectraMax自動酶標儀 美國Molecular Devices公司;HC-2066高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;Waters2695高效液相色譜儀、HPLC二極管陣列檢測器2998 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄酵素發酵 挑選新鮮、無腐爛、無霉變的葡萄,用榨汁機打碎,全部操作在無菌操作臺內進行;加入0.1 g/L果膠酶,酶解溫度40 ℃,酶解時間30 min。紅糖、白糖、蜂蜜用紫外殺菌1 h,按果汁∶碳源=100∶60 g/g的比例在果汁中分別添加紅糖、白糖、蜂蜜,對照組未添加外源碳源,同時測定培養基中固形物含量和還原糖含量,并于厭氧條件下室溫靜置發酵15 d,每3 d取樣檢測[9-10]。

1.2.2 微生物指標測定 酵母菌總數、乳酸菌(嗜熱鏈球菌、乳桿菌)總數:分別參照GB 4789.15-2016[21]、GB 4789.35-2016[22],根據菌落形態計數[6]。

1.2.3 理化指標測定 乙醇含量、pH、總酸、可溶性固形物含量及還原糖測定方法,詳見表1所示。其中,可溶性固形物含量及還原糖含量是在發酵前檢測,而乙醇含量、pH及總酸含量是在發酵的不同時間取樣檢測。

表1 理化指標測定

1.2.4 有機酸含量測定 參照Zotou等[23]法適當改進:取10 mL酵素樣品于容量瓶中,定容至100 mL。C18固相萃取小柱用10 mL甲醇、10 mL水活化,將上述稀釋后酵素樣品過柱除去色素等雜質,棄去前6 mL流出液,收集后段流出液,使用0.22 μm濾膜過濾后進行液相分析。色譜條件:色譜柱ODS-C18(4.6×250 mm,5 μm);流動相為97%磷酸二氫鉀溶液(0.05 mol/L,用磷酸將pH調至2.5):3%甲醇;洗脫程序為等梯度洗脫;流速0.6 mL/min;檢測波長210 nm;柱溫30 ℃;進樣10 μL。各有機酸標準品標準曲線如表2所示。

表2 5種有機酸標準品標準曲線回歸分析

1.2.5 SOD酶活測定 參照GB/T 5009.171-2003[24],采用Marklund方法。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 參照Sadabady等[25]法,稍作修改。取50 μL稀釋至1%濃度的樣液于試管中,加入400 μL 1×10-4mol/L DPPH甲醇溶液,混勻后避光反應30 min。在波長517 nm下測定吸光值,對照溶液吸光值記為A0,樣品溶液吸光值記為A1,樣液本底吸光值記為A2,由公式1換算得自由基清除率,結果代入VC標準曲線(y=2.06x-6.681,R2=0.994),以VC當量含量(mg VC/L)表示。

DPPH自由基清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(1)

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力測定 參照Tai等[26]法,稍作修改。配置ABTS+自由基溶液:取等體積2.45×10-3mol/L K2S2O8與7×10-3mol/L ABTS+混合,25 ℃避光反應16 h后,用乙醇稀釋至734 nm下吸光值0.70±0.02,待用。取50 μL稀釋至1%濃度的樣液于試管中,加入400 μL ABTS+溶液,混勻后避光反應10 min。在波長734 nm下測定吸光值,對照溶液吸光值記為A0,樣品溶液吸光值記為A1,樣液本底吸光值記為A2,由公式2換算得自由基清除率,結果代入VC標曲(y=2.018x-1.423,R2=0.991),以VC當量含量(mg VC/L)表示。

ABTS+自由基清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(2)

1.2.6.3 OH自由基清除能力測定 參照Liu等[27]所述方法,取100 μL稀釋至1%濃度的樣液于試管中,加入100 μL 6×10-3mol/L FeSO4溶液和100 μL 2.4×10-3mol/L H2O2溶液,25 ℃避光反應10 min后,加入100 μL 6×10-3mol/L水楊酸溶液,30 ℃條件下反應30 min。在波長510 nm下測定吸光值,對照溶液吸光值記為A0,樣品溶液吸光值記為A1,樣液本底吸光值記為A2,由公式3換算得OH自由基清除率,結果代入VC標曲(y=0.404x+3.01,R2=0.99),以VC當量含量(mg VC/L)表示。

OH自由基清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(3)

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 葡萄酵素培養基固形物及還原糖含量測定結果

表3中,對照組未添加碳源,可溶性固形物含量及還原糖含量顯著低于添加碳源組(P<0.05)。添加碳源組中,紅糖、白糖組的可溶性固形物含量及還原糖含量差異不顯著(P>0.05),可能是紅糖與白糖主要由蔗糖等成分組成[18-19];蜂蜜組還原糖含量顯著高于紅糖、白糖組(P<0.05),這與Lee等[28]報道蜂蜜富含葡萄糖、果糖等還原糖一致。

表3 葡萄酵素培養基固形物及還原糖含量

2.2 外源碳源對酵母及乳酸菌生長的影響

水果酵素天然發酵的微生物以酵母為主,同時也含有部分乳酸菌[6]。添加碳源對微生物生長影響如圖1所示。

圖1 添加碳源對微生物生長的影響

圖1A顯示,對照組因未添加碳源,具有低滲透壓環境,發酵初始(0～3 d)酵母菌利用果汁具有的還原糖迅速生長,在3 d達峰值2.5×107CFU/mL,隨后下降,果汁中的營養物質消耗導致無法繼續滿足其生長需求,酵母菌進入衰亡期,菌體自溶,菌數在第6 d接近0;同時從圖1B看出,乳酸菌未檢出,推測是競爭性生長中酵母菌占絕對優勢,其快速生長及乙醇代謝遏制了乳酸菌繁殖[29]。

在添加碳源的各組中,初始糖質量濃度高于11 g/100 mL(表3)，使微生物生長初始受抑制[5,30],圖1A表明對酵母菌生長抑制作用由小到大依次為:蜂蜜、紅糖、白糖。其中,添加蜂蜜組的酵母菌數量增長速度及最大細胞濃度(第9 d峰值達1.355×107CFU/mL)顯著高于紅糖、白糖組(P<0.05)。結合表3可知蜂蜜中的還原糖含量最高(P<0.05),而蜂蜜主要由葡萄糖、果糖等多種單糖組成,因此滿足于酵母菌生長的營養需求,使酵母菌快速且持續更長時間生長[28]。相反,乳酸菌的生長以添加紅糖的效果為佳,其增長速度及最大細胞濃度均大于其它組(P<0.05),在第6 d達到峰值7.05×106CFU/mL(圖1B),這可能由于紅糖中含有豐富的營養物質及生長因子,包括礦物質、維生素、必需氨基酸等[31]。添加碳源組酵母菌、乳酸菌數量達到峰值后均下降,原因一是營養物質逐漸耗盡,二是代謝物的抑制,包括乳酸菌代謝產生的苯乳酸、環肽等抑制酵母生長,而乳酸菌生長受酵母乙醇代謝及產生的脂肪酸抑制[32],但它們的共生機理尚未清楚[33]。

2.3 外源碳源對微生物代謝的影響

2.3.1 乙醇代謝 發酵過程中各組乙醇含量呈上升趨勢,直至發酵結束,乙醇主要是由酵母菌糖代謝所生成[34]。發酵初期(3 d),對照組乙醇含量顯著高于添加碳源組(P<0.05),達4.3%vol,這是由于其低滲透壓環境利于酵母菌快速生長(圖1A)及進行乙醇代謝;添加碳源的各組在6～12 d乙醇含量提高幅度較大,12～15 d期間變化較小(表4),對乙醇代謝抑制能力由大到小依次為白糖>紅糖>蜂蜜,其中蜂蜜組發酵后乙醇含量高達4.74%vol,而白糖組僅為1.62%vol,這與前面酵母菌生長的結果一致(圖1B)。結果表明傳統酵素釀制添加較高濃度碳源,可減緩酵母菌生長和乙醇代謝速率,并以白糖、紅糖添加為佳;楊小幸等[5]報道以白糖為外源碳源進行蘋果酵素自然發酵,前14 d未檢測出乙醇,在第21 d乙醇含量達3.45%±0.92%vol,與本試驗添加碳源顯示相同的規律,但不同水果原料攜帶菌種不同,水果原料的營養物質也不同,導致自然發酵中乙醇代謝能力存在差異。

表4 添加不同碳源下的乙醇代謝

2.3.2 總酸代謝與pH變化 總酸含量變化是衡量酵素發酵成熟度的標識之一,為酵素的主要理化指標[35]。各組發酵過程中pH和總酸含量變化如圖2所示。

由圖2可知,對照組發酵后pH上升,總酸含量減少,與添加碳源組呈相反規律,可能對照組糖含量較低,酵母菌利用有機酸為碳源進行生長代謝。紅糖、白糖、蜂蜜組pH變化差異顯著(P<0.05),在12 d內分別由初始值4.16、3.82、3.90降至3.83、3.54、3.64,后趨于平緩。對應的總酸含量在12 d內也呈上升趨勢,紅糖、白糖、蜂蜜組總酸含量分別由初值1.02%、0.71%、0.8%升至1.17%、0.8%、0.91%,然后趨于平緩,這與發酵過程中有機酸含量增加有關[35],其中紅糖組pH及總酸含量變化均大于其它組,這與前面乳酸菌變化規律(圖1B)一致。結果表明添加紅糖促進乳酸菌生長及產酸代謝,致使pH下降及總酸含量增大。蔣增良等[9]報道葡萄酵素添加紅糖自然發酵中pH在前8 d變低,之后趨于平緩,與本結果相似。

圖2 不同碳源下的發酵液pH(A)及總酸(B)變化

2.3.3 有機酸代謝 葡萄原料的有機酸以酒石酸、蘋果酸為主[36]。發酵前后碳源對有機酸代謝影響如表5所示。

表5 碳源對有機酸代謝影響

由表5可知,發酵初始,較于對照組,添加不同碳源對培養基的有機酸含量影響較大,其中紅糖組的含量顯著高于白糖、蜂蜜組,特別是乳酸和乙酸含量,在其它組中檢測不出,這表明紅糖給葡萄培養基帶入了多種類型有機酸(表5)。發酵15 d后,對照組的酒石酸、蘋果酸含量減少,可能是酵母菌以有機酸為碳源進行代謝活動。而添加碳源的各組,除了酒石酸含量出現下降外,其它有機酸含量均呈上升趨勢;其中白糖、蜂蜜組酒石酸含量輕微減少,而紅糖組酒石酸含量顯著減少(P<0.05),這是由于紅糖組較其它組存在較多乳酸菌,而乳酸菌能將酒石酸降解成乳酸、乙酸,使發酵后乳酸及乙酸含量提高[37]。同時,發酵后蘋果酸含量提高,可能是發酵體系中果膠酶對果肉作用,使得果肉中的有機酸等不斷浸出引起[38]。有研究認為是蘋果酸被乳酸菌分解會導致含量減少[39],與本結果不一致,原因可能是本實驗果膠酶對果肉中蘋果酸的浸出量大于其被乳酸菌分解的量。

此外,各組檸檬酸含量發酵后均顯著增加(P<0.05),這可能是微生物通過三羧酸循環所合成,致使其含量增加,這與張婷等[40]考察木薯釀制過程中有機酸變化結果一致。

2.4 添加碳源對生物活性影響

圖3 不同碳源下發酵液SOD酶活的變化

由圖3可知,葡萄酵素發酵后SOD酶活均有提高,其中紅糖組顯著高于其它組(P<0.05),第9 d時SOD酶活達最大值91.05 U/mL。莫大美等[42]利用酵母及乳酸菌發酵制備玫瑰酵素,發酵9 d時產品SOD酶活性最高,與本實驗結果一致。SOD酶活提高原因是,發酵過程益生菌代謝活動分泌出SOD酶等生物活性物質[43],表現出更強的自由基清除能力。

發酵后期各組SOD酶活有所下降趨勢,原因是pH改變導致SOD酶活變化[44]。同時,隨著發酵時間的延長,一些活性物質如VC、VE及多酚等被氧化破壞[45],使酵素自由基清除條件變差,SOD酶活表現下降趨勢。

2.4.2 DPPH自由基清除能力 添加碳源可促進益生菌代謝產生SOD酶、有機酸等活性物質,因此發酵后自由基清除能力得以提高。IC50作為評定物質抗氧化能力常用的參數,指50%自由基清除率對應的樣品濃度[46],該值越小,表示樣品抗氧化性越強。具體由圖4所示。

圖4 不同碳源下DPPH自由基清除能力(A)及IC50(B)變化

由圖4A可知,各實驗組發酵后DPPH自由基清除率均顯著增大(P<0.05),其中紅糖組對DPPH自由基清除能力最大,為25.79 mg VC/L,較發酵前提高了32.53%。發酵后,各組IC50值由大到小依次為對照組>白糖組>蜂蜜組>紅糖組(圖4B),即抗氧化能力大小依次為紅糖組、蜂蜜組、白糖組、對照組,這與總酸、SOD酶活(圖2B、圖3)呈正相關,而有機酸、SOD酶具有清除自由基的能力[12,43]。對DPPH自由基清除能力最大為紅糖組,結果表明添加紅糖發酵具有更強抗氧化性。

2.4.3 ABTS+自由基清除能力 圖5A中,各組發酵后ABTS+自由基清除率均顯著提高(P<0.05),與DPPH自由基清除率一致。發酵后,紅糖、白糖、蜂蜜及對照組ABTS+自由基清除率分別為37.12、16.15、18.77和13.54 mg VC/L,結合圖5B中發酵后紅糖組IC50值(0.72%)最低,表明酵素添加紅糖對ABTS+自由基有更強的清除作用。結合圖4知,紅糖組對ABTS+自由基能力(37.12 mg VC/L)大于DPPH自由基清除能力(25.79 mg VC/L),這與蔣增良等[9]添加紅糖釀造葡萄酵素時,ABTS+自由基清除率增幅大于DPPH自由基清除率的結果一致,這可能是因為ABTS+自由基能與更廣泛的抗氧化物質反應[47]。

圖5 不同碳源下ABTS+自由基清除能力(A)及IC50(B)變化

2.4.4 OH自由基清除能力 由圖6A可知,發酵初始添加碳源組對OH自由基清除能力均與對照組相當,說明外源碳源具有的活性物質對OH自由基清除作用不大,但發酵后紅糖組的OH自由基清除率顯著高于白糖和對照組(P<0.05),原因可能是紅糖促進微生物產生SOD酶、有機酸等多種活性物質,使發酵后抗氧化活性更高[12,43]。

圖6 不同碳源下OH自由基清除能力(A)及IC50(B)變化

較DPPH、ABTS+自由基清除率,葡萄酵素對OH自由基清除作用更為高效,其中1%濃度紅糖組(發酵15 d)達148.23 mg VC/L,這與蔣增良等[12]報道葡萄酵素對羥基自由基具有極高清除活性一致,同時表明添加紅糖作為外源碳源,可使發酵產物抗氧化能力增大。

3 結論

葡萄酵素補充合適的碳源自然發酵可減緩酵母菌生長及乙醇代謝,同時促進乳酸菌的生長,避免了造成乙醇含量偏高,并代謝更多有機酸等活性物質,但不同碳源產生的影響不同,其中,添加白糖發酵15 d乙醇含量為1.62%vol,顯著低于紅糖與蜂蜜碳源,僅為對照組的24.00%。實驗組總酸在發酵周期內呈先上升后趨于平緩趨勢,與對照組單邊下降趨于平緩的趨勢相反。添加碳源后葡萄酵素發酵提升蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸含量,但會降低酒石酸含量。添加碳源發酵可提高葡萄酵素的活性,其中添加紅糖獲得的SOD酶活明顯高于其它實驗組和對照組,達到91.05 U/mL;抗氧化活性(DPPH、ABTS+、OH自由基清除能力)具有相同結果,分別為25.79、37.12、148.23 mg VC/L。優化添加碳源進行葡萄酵素發酵,可提升發酵產品的營養價值。