一種新的油桐黑斑病病原及其生物學特性研究

徐紅梅 鄧先珍 杜洋文

摘 要：本文報道了湖北省武陵山區一種新的油桐黑斑病病原真菌，并對其開展了生物學特性和對農藥敏感性研究。從油桐黑斑病發病葉片中分離到的JF-4菌株生長迅速，致病力強。菌株培養性狀、產孢特征結合核糖體rDNA基因轉錄間隔區（ITS）和RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）分析表明該菌為小新殼梭孢Neofusicoccum parvum。該病原菌對環境適應能力較強，對5種供試殺菌劑敏感性不同，43%戊唑醇懸乳劑抑菌率最高。

關鍵詞：油桐黑斑病;病原鑒定;生物學特性;毒力測定

中圖分類號：S763.1 ??文獻標識碼：A ??文章編號：1004-3020（2020）01-0027-04

Abstract：A newly identified pathogen of Mycosphaerella aleuritidis and its biological characteristics was studied in this paper.Isolated from diseased leaves，the pathogen of JF-4 grew rapidly with strong pathogenicity.Based on cultural character，sporogenous structure，ITS with RPB2 analysis，Neofusicoccum parvum was the newly identified pathogen.The mycelia could grow under different environment with good acclimatization.Toxicity of 5 fungicides to the pathogen was tested in the lab. Different fungicides inhibited the growth of mycelia at different levels，and 43% tebuconazole SE showed best effect.

Key words：Mycosphaerella aleuritidis;pathogen identification;biological characteristics;toxicity test

油桐是大戟科油桐屬植物統稱，是中國特有的油料樹種，其種子中含有的桐油不僅是重要的工業油料，也是生物柴油的主要原料之一。油桐在中國亞熱帶地區的丘陵地帶種植范圍較廣。武陵山區自然條件適于種植油桐，歷史上一直是中國桐油中心產區。油桐產業是該區重要的特色資源產業[1]。

良好的撫育管理措施是保證油桐豐產、高產的前提條件，病蟲害防治是油桐栽培管理的關鍵環節[2]。油桐黑斑病又稱為角斑病，果實黑疤病，能引起嚴重的枯果和落果。在油桐產區發生普遍，該病主要發生在葉片、葉柄和果實上，病葉初期出現褐色小點，逐漸擴大成圓斑或因受葉脈的限制而成多角形的病斑，多數病斑可以相互聯合成大塊斑。病害嚴重者，全株枯死。過去認為，該病主要由油桐尾孢菌Cercospora aleuritidis Miyake.侵染所致[3-4]。

作者對湖北省武陵山區油桐病蟲害進行了調查，其中油桐黑斑病發生十分嚴重。本文對該地一株新的油桐黑斑病病原進行了鑒定和生物學特性研究，以期為病害發生規律及防治研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 病原物

黑斑病發病葉片源自湖北省來鳳縣百福司鎮沙道灣村油桐林，供試JF-4菌株采用組織分離法分離并純化后保存于4 ℃冰箱備用。

1.2 致病性測定

采用離體接種法測試JF-4菌株的致病性。油桐健康葉片源自湖北省林科院九峰油桐示范林。剪取健康葉片，放入保鮮盒中，取長滿培養皿的菌絲塊緊貼在葉片表面，對照加無菌培養基塊，25 ℃恒溫培養，保持90%相對濕度。48 h后觀察葉片發病情況，并記錄發病癥狀。將發病葉片進行組織分離，獲得再分離菌株，與原接種菌株進行對比。依照柯赫氏法則判定菌株是否為致病菌

1.3 病原菌的培養性狀、產孢結構觀察與分子測序

將JF-4菌株接種在PDA平板上，25 ℃培養3 d，觀察培養性狀和特征，主要包括生長速度、菌絲顏色、是否有氣生菌絲、菌落結構及色素產生情況等;觀察病斑組織的解剖特征并將菌株接種在水瓊脂添加無菌松針（馬尾松）培養基，25 ℃恒溫黑暗培養25 d左右，近紫外光照射（誘導產孢）。挑取載孢體，在光學顯微鏡下觀察、記錄產孢結構和孢子形態特征。

病原物基因組提取采用微波爐裂解法。核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS1-5.8S-ITS2）基因擴增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[5]，RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）擴增采用引物RPB2bot6F（5′-GGTAGCGACGTCACTCCC-3′）和RPB2

bot7R（5′-GGATGGATCTCGCAATGCG-3′）[6]（PCR擴增反應條件為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36次循環;最后72 ℃延伸10 min。PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。病原物ITS和RPB基因序列進行BLAST比對后獲得多個匹配的序列記錄，用CLUSTAL X軟件包進行多序列比對。

1.4 病原菌生物學特性研究

1.4.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響

將供試菌株在25 ℃恒溫箱中預培養3 d，于菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板上，分別置于10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫箱中培養，每個處理重復3次，4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.2 pH值對病原菌菌絲生長的影響

用1 mol·L-1 HCL和1 mol·L-1 NaOH調節PDA培養基的pH值至4、5、6、7、8、9（酸度計測量pH值）。按1.4.1所述方法分別接種菌餅于不同pH值PDA培養基，置于25℃恒溫箱中培養。每個處理重復3次，4 d后測量菌落直徑。

1.4.3 碳源和氮源對病原菌菌絲生長的影響

以查彼培養基為基礎培養基（硝酸鉀2.0 g，磷酸氫鉀1.0 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL）。供試碳源為葡萄糖30.0 g，甘露醇27.6 g，可溶性淀粉24.55 g，麥芽糖27.25 g，蔗糖25.9 g（用量以葡萄糖30.0 g含碳量10.9 g為標準進行換算），滅菌后接種，以無碳源處理作為對照。每個處理重復3次，置于25 ℃恒溫箱中培養，4 d后測量菌落直徑。

供試氮源為硝酸鉀10.0 g，尿素3.0 g，硫酸銨6.6 g，甘氨酸7.5 g，硝酸銨4.0 g（用量以硝酸鉀10.0 g的含氮量1.4 g為標準進行換算），滅菌后接種，以無氮源處理作為對照。每個處理重復3次，置于25 ℃恒溫箱中培養，4 d后測量菌落直徑。

1.4.4 不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的毒力測定

在無菌操作條件下，將供試殺菌劑分別用無菌水稀釋成所需濃度10倍于供試濃度的5個系列濃度梯度的藥液。向培養皿中加入藥液1 mL，再加入9 mL冷卻至50～60 ℃的PDA培養基，充分混勻，最終配制成所需濃度的含藥培養基，以不含藥劑的培養基作為對照，每個濃度重復4次。供試藥劑和使用濃度見表1。

采用生長速率法對菌絲生長進行室內毒力測定[7]：在每個含藥劑平板中央接入一塊直徑為5 mm的菌餅，25 ℃恒溫箱中培養4 d后測量菌落直徑，根據以下公式計算各藥劑濃度對菌絲生長的抑制率。所得數據經SPSS19.0統計軟件進行數據處理，求出各藥劑毒力回歸方程、EC50及相關系數。

抑菌率（%）=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑-菌病直徑×100

2 結果和分析

2.1 病原物致病性

葉片接種JF-4菌株3 d后出現褐色病斑，病斑形狀不規則，在25 ℃恒溫和高濕環境下，病斑擴展迅速，15 d后部分供試嫩葉整葉褐化壞死。發病葉片組織分離后所得再分離菌株與接種菌株特征一致，符合柯赫氏法則。

JF-4菌株引起葉片產生黑斑病，為油桐黑斑病病原真菌。

2.2 病原物的培養性狀、產孢結構觀察及分子鑒定

JF-4菌株在PDA培養基上生長迅速，氣生菌絲發達;生長初期菌落呈白色，后逐步轉為灰色。在野外病株和人工接種病斑組織中觀察不到該菌有性或無性繁殖結構，而該菌在誘導培養（含無菌松針的水瓊脂+近紫外照射）條件下可產生子實體。分生孢子器梨形或球形，分生孢子單胞，近橢圓形。

PCR產物瓊脂糖電泳結果顯示，ITS和RPB2基因片段大小均在500bp左右。BLAST序列對比表明這兩個基因序列與GenBank數據庫中多個Neofusicoccum菌株的相似性達到100%。

結合JF-4菌株培養性狀、產孢特征以及核糖體rDNA基因轉錄間隔區（ITS）和RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）序列分析[8-10]，將該病原菌鑒定為小新殼梭孢N.parvum，該菌是葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae菌物的無性型。

2.3 病原菌生物學特性

2.3.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響

該菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長，25～30 ℃菌絲生長較快，其中25 ℃為最適生長溫度，培養4 d后菌落平均直徑為85.0 mm。高溫和低溫均不利于菌絲生長。當溫度低于10 ℃或者高于40 ℃時，菌絲生長速度緩慢（見圖1）。

2.3.2 pH值對病原菌菌絲生長的影響

該菌在pH值4～9范圍內生長速度均較快，培養4d后菌落平均直徑為54.3～85.0 mm;其中pH值為7是最適生長pH值，菌落平均直徑為85 mm，pH值8～9時菌落生長速度稍微降低，菌落直徑為72.7～80 mm（見圖2）。由此可見，該菌對環境酸堿性適應性強。

2.3.3 碳源和氮源對病原菌菌絲生長的影響

該菌在供試5種碳源培養基中均能生長，菌落生長速度遠大于缺碳對照，在葡萄糖培養基上菌落直徑最大，培養4 d后菌落平均直徑為85.0 mm，其次是蔗糖、淀粉和麥芽糖、甘露醇。總體說來，該菌利用環境中碳源能力很強。不同碳源培養基上菌落培養性狀差異不大，葡萄糖為該菌菌絲生長的最佳碳源（見圖3）。

從圖4可以看出，該菌在供試5種氮源培養基中均能生長，菌落生長速度遠大于缺氮對照，在硫酸銨培養基上生長速度最快，培養4 d后菌落菌落平均直徑達到85.0 mm，其次是尿素、硝酸銨、硝酸鉀和甘氨酸。總體說來，該菌利用環境中氮源能力很強。不同氮源培養基上菌落培養性狀差異不大，硫酸銨為該菌菌絲生長的最佳氮碳源。

2.3.4 不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響

室內毒力測定結果表明，供試5種殺菌劑對該病原菌毒力不同，從大到小依次為：43%戊唑醇懸乳劑﹥50%多菌靈超微可濕性粉劑﹥12.5%氟環唑懸乳劑﹥70%代森錳鋅可濕性粉劑﹥75%百菌清可濕性粉劑。43%戊唑醇懸乳劑對該病原菌的抑制效果最好，75%百菌清可濕性粉劑效果最差，各殺菌劑對油桐枯萎病的室內毒力測定結果見表2。

3 結論與討論

本文報道了湖北省武陵山區一種新的油桐黑斑病病原真菌，并開展了病原菌生物學特性和對農藥敏感性等研究，為研究該病害的發生規律和防治提供理論依據。

從油桐黑斑病發病材料中分離到的JF-4菌株生長迅速，致病力強。培養性狀、產孢特征結合核糖體rDNA基因轉錄間隔區（ITS）和RNA聚合酶次大亞基基因（RPB2）分析表明該菌為小新殼梭孢。

生物學特性研究表明，該病原菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長，最適生溫度為25～30 ℃;病原菌在pH值4～9范圍內生長速度均較快，表明病原菌對環境酸堿度適應能力較強，在酸性、中性和堿性土壤條件下均能快速生長。該病原菌能利用環境中的多種碳源和氮源，葡萄糖和硫酸銨分別為該菌菌絲生長的最佳碳源和氮源，在生產管理中應注意合理施肥。總體說來，該油桐黑斑病病原菌對環境適應能力很強，生長迅速，該生物學特性為其快速侵染和傳播奠定了基礎。

室內毒力測定結果表明，供試5種殺菌劑對該病原菌毒力不同。毒力較強殺菌劑為：43%戊唑醇懸乳劑、50%多菌靈超微可濕性粉劑和12.5%氟環唑懸乳劑;毒力較差殺菌劑為：75%百菌清可濕性粉劑和70%代森錳鋅可濕性粉劑。生產過程中可以參考本研究結果，選擇43%戊唑醇懸乳劑等殺菌劑防治此類油桐黑斑病。

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（責任編輯：唐 嵐）