真菌毒素免疫親和柱的制備與評價

金曉林 張東升

[摘要]免疫親和凈化（IAC）是以免疫結合反應原理為基礎的純化和富集技術。IAC在食品安全、農業和生化等中的研究與應用已被色譜工作者接受和認同，展示了廣闊的發展前景。本文旨在全面介紹IAC的工作原理、制備方法、評價指標，重點綜述了IAC在真菌毒素分析領域的質量控制。

[關鍵詞]免疫親和;真菌毒素;制備;評價

中圖分類號：TS207.5 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202002

真菌毒素是由產毒真菌在適宜的環境條件下產生的有毒代謝產物，已經發現400多種真菌毒素，其中污染較嚴重的主要包括黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素（Ochratoxin A，OTA）及伏馬菌素（Fomonisin，FB）等[1]。2017年百奧明公司的調查研究中發現[2]，超過75%的樣本被檢出兩種或更多的真菌毒素，其中ZEN、DON及FB的陽性率均超過了50%，DON污染濃度最高。當各種真菌毒素在農產品中同時出現，存在毒性加和或者疊加效應[3]，對健康的威脅系數增大，因此有必要對多種真菌毒素同時進行檢測。

國內外真菌毒素常用的儀器分析方法主要為免疫親和層析（Immuno-affinity Column，IAC）結合液相色譜法（liquid chromatography，LC）及液相色譜-質譜聯用（LC-MS）檢測[4-5]等。與固相萃取柱（SPE）相比，IAC具有溶劑用量少、操作簡便、特異性高、凈化徹底等優點，這對于提高HPLC和LC-MS的檢出限、消除背景干擾是非常必要的。針對生物毒素小分子凈化和富集的IAC柱在國內外已經得到商品化并廣泛應用[6]。本文在介紹IAC的工作原理、載體活化、抗體制備及偶聯方式的基礎上，重點闡述了IAC質量評價的必要性及評價要點。

1 免疫親和層析

1.1 原理及優勢

IAC是利用抗原抗體特異性可逆結合特性的親和層析技術，將抗體與惰性載體共價結合物填入柱中制成的凈化色譜小柱。IAC系統存在三個要素：目標物、抗體和惰性載體。當含目標物的樣本提取液通過IAC柱時，固定于惰性載體上的抗體選擇性地結合目標物，雜質流出，進一步洗滌除雜后將復合物解離，目標物被洗脫，樣本得到凈化。因抗體是其核心試劑，樣品的免疫凈化又稱抗體介導的凈化。其工作原理如圖1所示 。

IAC較常規的SPE有許多優點：（1）IAC中抗體對目標物的高度選擇性使樣本前處理過程簡化，分析質量得到改善。避免了反復萃取和濃縮，回收率高。（2）對目標物具有高效保留能力。在IAC柱容量范圍內，IAC對于目標物的保留能力和凈化能力不受樣本體積和目標物濃度的影響。（3）多殘留分析能力。固定有多種抗體或者簇特異性抗體的IAC柱可對多種目標物進行凈化。（4）水相操作且IAC柱可重復使用，能夠節約有機溶劑，保護環境。

1.2 載體分類及活化

IAC柱的絕大部分空間為載體基質所占據，其影響不可忽視。理想的基質必須既有優良的色譜性能，又能滿足IAC的特殊要求[7]，如高度的親水性但不溶于水，適度的剛性、惰性、無非特異性吸附或者非常低，理化性質穩定，具有大量可供偶聯的活性基團，疏松多孔結構，耐受酸、醇等洗脫作用。實際應用中的載體基質通常分為耐受低壓的多糖類物質及耐受高壓的聚合材料。多糖類物質除瓊脂糖還有纖維素[8]等。代表性聚合材料有聚丙烯酰胺[9]、硅膠[10]等。纖維素及玻璃珠因非特異性吸附高使用受到一定的限制。

多糖基質的活化在IAC制備中占有重要位置。通常在骨架上引入強親電基團，然后與抗體上的親核基團如-NH2、-OH、-SH等發生取代反應，使抗體連接于載體上。如果需要使抗體通過間隔臂與基質連接，除可以選擇適宜的活化試劑外，也可以首先將間隔臂（如SMCC）[11]與基質連接，再將抗體與間隔臂的活性基團偶聯。常用的載體活化方式包括溴化氰活化（CNBr）[12]、碳酰二咪唑法（CDI）[13]等。

1.3 抗體的制備

依據抗體的來源可分為單克隆抗體（McAbs）和多克隆抗體（PcAbs），通過單克隆抗體生產途徑不同又可以分為體內和體外，具體區別如表1所示?，F階段制備真菌毒素McAbs的主要途徑依然是小鼠腹腔注射細胞誘導產生，受動物福利及抗體質量影響，細胞發酵生產單抗具有極大的發展空間[14]。

McAbs在建立IAC具有較多的優越性。其一，具有高度均一的親和性和選擇性，純化后的單抗易于制備高容量的IAC柱。其二，制備IAC需要消耗大量的純化抗體，如1支典型的DON-IAC柱所需要的抗體近乎1～2mg[15]，雜交瘤技術的建立，可源源不斷地提供性能均一的McAbs。其三，作為凈化手段的IAC，具有交叉反應的單抗適宜制備處理多殘留組分的Multi-IAC。綜合各種因素，一般認為McAbs的突出優勢是高度均一性，生產成本低，適于商業生產和推廣應用。

1.4 偶聯方式

使固定化的抗體維持高密度、高活性是制備一次性、大容量、低成本IAC柱的關鍵。但是，當抗體被固定在載體表面時，其活性通常比溶液中要低，活性降低的主要原因在于：一是高密度造成抗體分子的空間位阻;二是載體表面抗體的隨機偶聯。因此，抗體高度定向化的方法被陸續開發出來，主要有3種形式，如表2所示，其中通過蛋白結合單抗固定化應用最為廣泛，但因同源交聯劑無選擇性反應而導致抗原結合域修飾，是其最大缺陷。

2 質量評價

IAC作為生化類產品，在分析領域逐步被推廣應用，商業化的步伐加快，市場潛力巨大，至今國內外尚無商品化的免疫親和柱質量標準或規范。產品生產、使用及評價體制尚不完善，其性能和質量控制尚不能滿足檢測需要。為了把好產品質量關，促進我國生化檢測產業健康、有序地發展，急需建立一個關于IAC產品質量的指導性標準。

2.1 評價的必要性

（1）IAC已作為食品安全相關國家和行業標準檢測方法中的關鍵生化試劑材料，應強化質量控制管理。目前已有專門針對抗生素[20-21]、農藥[22]和真菌毒素[23-26]等的各類免疫親和柱產品，尤其真菌毒素類親和柱種類最為齊全。經檢索采用IAC作為凈化手段的測定方法標準共有20項，其中國家標準18項、行業標準2項，其質量直接影響我國食品安全監測和第三方檢驗結果的準確性和可靠性。

（2）IAC產品技術性能指標不統一、不規范。目前，IAC生產企業要為每一種IAC產品制定標準，且各類標準存在如下問題：一是同一企業、不同品種的標準，其內容僅是冠名的簡單替換;二是不同企業IAC的制備方法不一致，在柱容量、非特異性吸附、柱空白等關鍵指標差異大，導致假陰/陽性測定結果;三是不同企業對IAC產品的重現性和穩定性等關鍵質量指標要求不一，產品市場混亂，檢測單位無所適從，難以選擇。

2.2 評價內容

2.2.1 建立原料質量的評價體系

（1）對于單抗的質量指標主要有親和常數和交叉反應率。①抗體的親和性（affinity）是抗體與半抗原間結合強度的量度，一般用結合反應的熱力學參數平衡常數（Ka），又稱親和常數、結合常數，單位L/moL。Ka值越高，結合能力越強，一般抗原抗體反應的Ka值為106～1 012L/mol。②抗體的選擇性或稱特異性（specificity）是抗體對待測物的識別能力，是評價抗體與待測物間結合反應的專一性和對結構相近或相關物質的區分能力。在多數的免疫分析中對抗體的特異性有嚴格的要求，而單一IAC對于抗體的特異性沒有完全的排他性，多組分IAC抗體及組合抗體對于類似物的交叉反應有一定的最低要求[27]。

（2）載體的粒徑直接決定了樣本的流速，載體的非特異性吸附率決定了洗脫率，這兩個指標對于IAC的處理時間和回收率至關重要。同時載體的粒徑也影響蛋白的結合能力，易建科[28]研究發現200目的氨基硅膠微球受比表面積大，單位體積內的活性基團多的原因，結合蛋白的能力比100目的微球大，對于制備大柱容量的IAC非常有益。①半抗原和抗體的初級結合反應可以在瞬間完成，一般IAC對于加樣流速要求并不嚴格，0.5～3.0mL/min均有應用，一般常用的瓊脂糖載體粒徑為90?m，1mL層析小柱的尺寸徑高比為0.55（同樣凝膠體積為0.25mL時，3mL的層析柱徑高比為1.78），徑高比越大，重力流速越快。②載體非特異性吸附率是除抗體外對IAC質量影響最大的因素。多數活化與偶聯過程引入的陰離子交換基團或陽離子交換基團成為非特異性吸附的重要來源。當親和柱被過量上樣時，樣品中的待測物除可與特異性抗體結合外，還可與瓊脂糖基質或雜蛋白發生非特異性吸附作用，通常用非特異性吸附率來表示，因為無法在親和柱上直接測量待測物的非特異性吸附量，所以制備未偶聯特異性單抗的瓊脂糖凝膠柱（以下簡稱blank柱）對待測物的吸附作用，以非特異性吸附率來表示[29]。一般要求基質非特異性吸附率低于5%。

2.2.2 建立技術性能的評價體系

（1）柱空白，指商品化免疫親和柱含分析物的含量，理應為0。董曼佳[30]等在制備DON及其乙?；H和柱時發現了空白柱含有一定的DON，研究發現其來自原料單抗，文獻表明通過飼喂含有一定低劑量的真菌毒素飼料，其衍生物及本身會殘留在動物的血液及組織液中，而腹腔中大量的抗體更是結合抗原最好的場所。

（2）柱體積，因IAC具有高效保留能力，所以IAC均采用較小的柱床體積，節約成本和減小非特異性吸附，通常不超過0.5mL;通常3～5倍柱體積的純有機溶劑即可將待測物完全洗脫。

（3）柱容量，每毫升免疫吸附劑對分析物的最大吸附量（ng/mL），也稱動態柱容量。動態柱容量與柱內免疫吸附劑體積的乘積即為單支柱最大吸附量（ng）。測定方法可通過超過理論容量的待測物使IAC柱飽和，經洗滌和洗脫后測定。為避免IAC樣本超載而出現待測物流穿現象，需根據柱容量進行設計待測物的處理量。

（4）柱回收率，也稱柱效，含分析物的基質提取液，被IAC吸附與解吸的過程，通過檢測分析物的回收率來表示親和柱對分析物捕獲能力。該回收率不含標準物質的提取效率，僅反映的是樣本基質對免疫結合反應的抑制效應，通過國標[31-32]可以推測理想柱效在90%～110%。

（5）柱穩定性，是指計量特性隨時間不變化的能力，可以用計量特性隨時間變化的關系來進行定量表征。選取3個不同批次適量的IAC柱，置37℃恒溫加速試驗1個月，測定柱容量及柱回收以評價穩定性[33]。

2.2.3 操作條件的標準化

（1）抗體抗原的最適反應溫度是37℃，從冰箱中取出的IAC需平衡至室溫25℃左右或室溫下的緩沖液快速淋洗IAC，是確保其抗體免疫活性的重要措施。

（2）因不同的抗體耐受有機溶劑的濃度[34]和耐受酸堿的能力各不相同，所以上樣緩沖液、沖洗液工作時的標準pH值一般使用具有緩沖能力的磷酸鹽緩沖液，pH 值為7.0～7.4。

（3）淋洗液或者上樣的有機相的濃度如甲醇一般不超過20%，乙腈不超過10%。

（4）過高的離子強度（NaCl>0.5mol/L ）可能促使抗原抗體復合物的解離。

3 問題與展望

3.1 存在問題

傳統IAC柱應用十多年來，問題依然存在，主要表現：（1）成本高。為避免重復使用和加快分析速度，一次性IAC柱成為趨勢。（2）浪費大。國內外多采用溴化氰活化的瓊脂糖為載體將抗體分子隨機的固定在層析介質上，抗體的結合能力下降，造成抗體分子被低效利用。（3）產品不穩定、回收率高。國內外多通過小鼠腹腔誘導抗體，單位產量低，批間存在較大的差異，存在抗原污染的風險。（4）雖然產業化快，但是質量標準滯后。國內IAC的研發起步較晚，但發展迅速，基本改變依賴國外進口的局面。已出臺的多項采用IAC凈化的測定方法標準，雖然對IAC已有一些質量要求諸如柱容量、回收率，但不系統、不全面。

3.2 展望

標準化單克隆抗體生產和供應依然是IAC真正實現一次性IAC柱的前提;優化載體活化方法、定向偶聯的方式，提高單抗的利用率是降低IAC使用成本的關鍵;開發全自動IAC純化儀是避免人為操作不當、人為使用低效的有效途徑;加快制定IAC通用技術評價規范，是滿足檢測結果準確性的客觀需求。

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收稿日期：2019-12-24

作者簡介：金曉林，男，高級工程師，研究方向為食品安全與品控。

通信作者：張東升，男，副研究員，研究方向為食品安全與營養。