基于網絡藥理學的赤芍治療動脈粥樣硬化作用機制研究

王心意，鞠建慶，田園碩，樊懿萱，徐 浩

據《中國心血管報告2018》統計，以冠心病和腦卒中為代表的動脈硬化性心血管疾病(ASCVD)死亡人數占我國居民疾病死亡構成的40%以上，居各病因之首，以血管壁功能紊亂和粥樣斑塊為特征的動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是ASCVD的病理基礎[1]。中醫藥在防治AS中發揮著重要作用，其中清熱活血中藥赤芍(Paeoniae Rubra Radix)是具有抗AS作用的代表藥物之一。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根。其味苦，性微寒，歸肝經，《醫學衷中參西錄》記載：“化瘀血，赤者較優……為其能化毒熱之瘀血不使潰膿也”[2]?，F代研究表明，赤芍具有抗凝、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗內毒素等多種藥理學作用[3]。動物實驗表明，赤芍對家兔實驗性AS病灶具有明顯的消退作用[4]。然而，其抗AS的藥效物質基礎和作用機制尚不清楚。網絡藥理學是新興的藥物研究模式，從整體角度探索藥物與疾病之間的關聯性，強調從“單靶標”向“網絡靶標”研究模式轉變[5]。本研究基于網絡藥理學，對赤芍治療AS的活性成分和其信號通路進行預測分析，為進一步臨床應用提供思路和依據。

1 資料與方法

1.1 赤芍活性化合物及靶標蛋白的篩選 利用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[6]，以“chishao”為關鍵詞檢索赤芍中的化學成分，篩選出赤芍化合物中符合口服生物利用度 (OB)[7]≥30%和生物活性分子的類藥性(DL)[8]≥0.18的化學成分作為活性成分。同樣基于 TCMSP 平臺，通過檢索獲得赤芍中活性成分所作用的靶標。

1.2 疾病靶點的篩選 通過GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)、OMIM數據庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)，以“atherosclerosis”為關鍵詞檢索已報道的與AS相關的基因，去除重復基因和假陽性基因。將獲得的基因與赤芍有效成分作用的靶標進行比對取交集，得到赤芍治療AS的作用靶點用于后續的研究。

1.3 蛋白相互作用網絡構建與分析 為了進一步了解赤芍靶點和疾病靶點在蛋白水平上的作用機制，以STRING平臺(https://string-db.org)構建蛋白互作網絡(PPI)[9-10]，獲取蛋白互作關系。其中，物種設為“homo sapiens”(人類)，最低相互作用閾值設為中等置信度0.4“medium confidence”，其余參數保持默認設置。以網絡中的各靶基因的“節點連接度(Degree)”為指標，通過 Degree的測算篩選出網絡中的核心蛋白質靶標。

1.4 作用靶點類型歸屬 DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)是包含與人類疾病相關的基因和變體最完整的數據庫之一，可通過輸入基因獲得與該基因相關的疾病信息[11]。在該數據庫中選擇基因進行檢索，依次輸入赤芍治療AS的作用靶點，獲取作用靶點類型。

1.5 赤芍-活性成分-抗AS作用靶點網絡構建 將篩選之后赤芍治療AS的有效活性成分和作用靶點數據導入 Cytoscape 3.7.1 軟件，構建赤芍-活性成分-抗AS作用靶點網絡。Cytoscape的核心架構是網絡，每個節點(node)是基因、蛋白質或分子，節點與節點之間的連接(edge)代表這些生物分子之間的相互作用，節點的度值(degree)代表網絡中節點與節點相連的數目，度值越大，這個靶點越有可能成為化合物的關鍵作用靶點。

1.6 基因本體論(gene ontology，GO)和KEGG富集分析 將赤芍治療AS的靶基因導入Metascape數據庫(http://metascape.org)進行基因富集分析。Metascape是一種有效且高效的工具，旨在提供全面的基因列表注釋和分析資源[12]。以P<0.01作為差異具有統計學意義的篩選條件，設置min overlap=3，Min Enrichment=1.5，對獲取的靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。

2 結 果

2.1 赤芍活性成分篩選及候選化合物靶點預測 經過TCMSP平臺檢索，獲得赤芍的化合物119個。設定OB≥30% 和 DL≥0.18，篩選出活性化合物29個，基本信息見表1。將這些活性化合物在TCMSP數據庫平臺逐一進行比對，得到了這些活性化合物作用的靶點共41個。

表1 赤芍中29個活性化合物的基本信息

2.2 AS疾病靶點收集 基于GeneCards與OMIM數據庫共收集AS相關靶點基因，挖掘并刪除重復靶點，共收集到AS疾病相關靶點3 812個。將上述篩選出來的中藥中具有潛在作用的靶點基因和疾病靶點基因進行匹配映射并在線繪制韋恩圖，獲得共同靶點基因36個。詳見圖1。

圖1 赤芍活性成分-抗AS作用靶點韋恩圖

2.3 赤芍靶點PPI網絡的構建與分析 將屬于赤芍的36個靶點在STRING平臺構建PPI網絡模型，見圖2。并將得到的交集靶點信息進行基因名和Uniprot ID的標準化，具體信息見表2。圖2包含36個節點(其中隱藏2個游離節點)、157條邊，平均Degree為8.72。分別計算網絡圖中每個靶點的Degree，采用R包“ggplot2”繪制了Degree最大的前30個靶點的柱狀圖，見圖3。得到14個重要的AS相關蛋白質靶點，分別為IL6、ESR1、VEGFA、FOS、CASP3、AR、RELA、CYCS、PGR、HIF1A、CASP8、CASP9、AHR、CCNB1等基因(Degree≥10)。

圖2 AS與赤芍共有PPI網絡

表2 赤芍抗AS作用靶點

圖3 PPI網絡中的節點

2.4 作用靶點類型歸屬 將34個作用靶點依次導入DisGeNET數據庫，獲得相應的蛋白類型，見表3。結果表明，赤芍治療AS過程中涉及信號分子、轉錄因子、酶(氧化還原酶、水解酶、蛋白酶、激酶、轉移酶)、酶調節劑、受體等物質。

表3 赤芍活性成分治療AS作用靶點分類

2.5 中藥-活性成分-作用靶點網絡的構建 通過Cytoscape 3.7.1軟件建立赤芍-活性成分-抗AS靶點網絡圖，見圖4。共有50個節點(1個疾病節點，1個藥物節點，12個化合物節點、36個基因節點)和113條邊，其中12個綠色節點代表了赤芍的活性成分，36個藍色節點代表了抗AS靶點，113條邊代表了化學成分與AS靶點的相互作用。該網絡中，每個化合物平均與5.42個靶點相互作用，每個靶點平均與1.81個化合物相互作用，因此，赤芍的活性成分中存在1個化合物與多個靶點之間的相互作用，同時也存在不同化合物共同作用于同一個靶點的現象，這體現了中藥多成分與多靶點之間共同作用的機制。結果表明，赤芍的29個潛在活性成分中，與作用靶點直接相連的成分有12個，為赤芍治療AS的活性成分。包括黃芩素、β-谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、(+)-兒茶素、Spinasterol、谷甾醇、(2R，3R)-4-methoxyl-distylin、campest-5-en-3beta-ol、油酸乙酯、stigmast-7-en-3-ol、芍藥苷。

圖4 赤芍-活性成分-抗AS靶點網絡圖

2.6 GO和KEGG富集分析 Metascape中GO功能富集分析得到 GO 條目146個(P<0.05)，其中生物過程(biological process，BP)條目73個，分子功能(cellular component，CC)條目15個，細胞組成(molecular function，MF)相關的條目58個。詳見圖5。GO富集分析結果顯示，生物過程主要包括對類固醇激素的反應、對有毒物質的反應、細胞對脂質的反應、細胞對有機環狀化合物的反應、細胞對激素刺激的反應；細胞成分主要包括核染色質、核染色體部分、核染色體、染色質、質膜蛋白復合物、細胞溶質部分突觸前膜、轉錄因子復合物等；分子功能主要包括轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合、近端啟動子序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ調節區DNA結合、DNA結合轉錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、參與凋亡信號通路的半胱氨酸型內肽酶活性等，涉及細胞信號轉導等途徑。KEGG信號通路富集中靶點數量前20的信號通路主要包括細胞凋亡、白介素-17(IL-17)信號通路、流體剪切應力(FSS)與AS、缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、Toll樣受體(TLR4)信號通路、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信號通路等。詳見圖6。

圖5 赤芍抗AS靶點的GO分析

圖6 赤芍靶點的KEGG通路富集分析

3 討 論

根據專家共識，AS的主要證候包括痰瘀互結證、氣陰兩虛證、氣虛血瘀證和氣滯血瘀證[13]。赤芍具有清熱涼血、散瘀鎮痛之功效，是治療AS有潛力的藥物。通過網絡藥理學的研究，有助于系統全面闡釋赤芍治療AS的作用機制，為臨床治療AS提供新的思路。

本研究通過構建成分-靶點網絡得到赤芍中12個活性成分，且部分成分的有效性已被證實。有研究表明，芍藥苷抑制β抑制蛋白2抗體的表達，改善G蛋白偶聯受體信號轉導的過度脫敏，從而降低炎癥因子水平[14]。黃芩素可以明顯降低組織中丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，從而降低高脂血癥性脂肪肝大鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平[15]。此外，黃芩素可以通過降低氧化應激、炎癥反應對心肌細胞起到保護作用[16]。β-谷甾醇可降低高血脂大鼠血清TC、TG，抑制脂質過氧化，起到預防AS的作用[17]。鞣花酸通過對氧磷酸內酯酶防止低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過氧化及抑制高脂飲食大鼠的攝食量，防止AS[18-19]。豆甾醇具有強大的抗氧化、降血脂、抗炎、抗腫瘤、降血糖及甲狀腺抑制等作用[20]。兒茶素可以抗AS，與其降脂、抗氧化有關[21]。本研究通過匹配中藥靶點與疾病靶點，獲得赤芍治療AS的36個靶點基因。蛋白質相互作用網絡分析顯示，Degree≥10的節點包括IL6、ESR1、VEGFA、FOS、CASP3、AR、RELA、CYCS、PGR、HIF1A、CASP8、CASP9、AHR、CCNB1。動物實驗表明，IL6促進早期AS病變的發展[22]。ESR1是雌激素對脈管系統的AS具有保護作用的重要介質。一項回顧性研究提示，ESR1基因變異可能與AS風險增高有關[23]。有研究發現，小鼠AS斑塊中血管VEGFA表達與新血管形成顯著減少有關，提示VEGFA具有抗AS作用[24]。FOS基因被認為是AS進展和嚴重程度的因素之一，且新發現認為其是冠狀動脈疾病中煙草發揮毒性的新途徑[25]。Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9是凋亡蛋白酶，在AS斑塊中表達[26]。Liu等[27]發現AR在相對早期AS中占有重要地位，而減少AR的表達與更廣泛的AS相關。Akhta等[28]發現內皮細胞缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)通過觸發miR-19a介導的CXCL1表達和單核細胞黏附促進AS，并提出抑制內皮HIF-1α/miR-19a途徑可能是抗AS的治療選擇。Wu等[29]研究表明，AHR的激活可以誘導血管炎癥并促進Apo-E小鼠AS形成。RELA、CYCS、PGR、CCNB1等與AS的相關性研究尚少。

富集分析和靶點歸屬分析結果表明，赤芍抗AS涉及細胞過程、代謝過程等多個生物過程，有信號分子、轉錄因子、受體、蛋白和酶、酶調節劑、受體等多種物質參與，過程較復雜。KEGG分析顯示以上成分作用的靶標顯著富集于細胞凋亡、IL-17信號通路、FSS與AS、HIF-1信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路、甲狀腺激素信號通路、p53信號通路、TLR4信號通路、PI3K-Akt信號通路等多個通路。目前有較多證據表明，細胞凋亡，尤其是巨噬細胞凋亡，發生在AS的各個階段[30]。有研究證實，選擇性抑制PI3K-Akt信號通路能誘導巨噬細胞自噬，減少斑塊巨噬細胞的浸潤，抑制炎癥反應從而穩定AS易損斑塊[31]。而PI3K-Akt能直接或間接地影響p53等抑癌基因的表達從而調控細胞存活[32]。Th17由CD4T淋巴細胞分化而來，主要分泌IL-17。隨著AS方面研究的深入，IL-17和Th17都被發現與AS的發生發展密切相關，但二者在疾病發展和斑塊穩定性中作用的結果尚無一致定論[33-34]。既往認為白細胞介素-17A(IL-17A)會促AS形成[35]。但近年來有研究得出相反的結論，認為IL-17A表達缺陷可促進粥樣斑塊進展[36]。FSS由于其脈動的性質和血液流動，其數值并不穩定。有研究發現頻率諧波的劇烈變化可促使AS的發生，表明內皮細胞能夠感知和響應FSS的變化[37]。HIF-1是異二聚體蛋白，是低氧環境中細胞反應的主要調節因子之一，通過作用于內皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞的細胞特異性反應在AS的發展中起關鍵作用。有研究提出通過HIF-1表達/活化的信號通路可以對治療AS發揮巨大作用[38]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種炎癥標志物，由單核巨噬細胞分泌。有研究表明，TNF-α能通過刺激血管平滑肌細胞的遷移，促進內皮細胞表達黏附因子、炎癥因子，促進AS的發生與發展[39-40]。馬淑慧[41]通過分子機制研究，發現赤芍主要成分芍藥苷對血管內皮細胞腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)的介導信號的抑制作用是赤芍發揮活血化瘀、抗AS的重要作用機制之一，這個發現與本研究得出的結果也一致。目前甲狀腺激素與AS相關性尚未明確，相關研究提示，促甲狀腺激素可能是AS的獨立危險因素[42]。Michelsen等[43]證實了TLR4的遺傳缺陷與ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊面積減少有關，表明TLR4信號傳導與AS有密切聯系。

4 小 結

本研究基于網絡藥理學分析赤芍抗AS的作用機制，赤芍通過調控相應的細胞凋亡、IL-17信號通路、FSS與AS、HIF-1信號通路等發揮治療作用。本研究相關通路的分析與文獻報道基本一致，表明活性成分與靶點的可靠性。因此，赤芍中12個活性成分通過調控34個靶點，共同發揮抗AS的作用，體現了赤芍多成分、多靶點、多途徑治療的特點，采用網絡藥理學的方法也體現了中醫藥的整體觀與系統性，為中醫藥治療多因素導致的復雜疾病提供了新的途徑。