丁苯酞通過NLRP3炎性小體信號通路對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞焦亡的影響

張 瑋，馬靜萍

近年來，腦血管疾病發(fā)病率越來越高，急性腦梗死仍是腦血管病發(fā)病和死亡的主要原因，快速診斷和再灌注可以提高腦梗死存活率，然而，腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，I/R)會引發(fā)明顯的無菌性炎癥反應(yīng)，從而影響預(yù)后。腦缺血再灌注損傷是指各種原因引起腦缺血缺氧致腦組織壞死前，閉塞的腦血管再通恢復(fù)血流后腦組織損傷進一步加重的現(xiàn)象[1-2]。腦血流量的恢復(fù)可致活性氧(ROS)積累、細胞離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)等進一步損害缺血組織，從而引起無菌性炎癥反應(yīng)[3]。最近，在缺血性腦卒中病人中發(fā)現(xiàn)了一種由炎性小體介導(dǎo)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)激活導(dǎo)致程序性細胞死亡的促炎形式，稱為細胞焦亡[4]。一些研究強調(diào)，NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體可能對介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細胞損傷和卒中后死亡至關(guān)重要[5-7]。多年以來，國內(nèi)外學(xué)者都證實了丁苯酞可通過各種機制減輕缺血引起的腦損傷，包括增加半暗帶區(qū)腦血流量、抗血小板聚集、抑制血栓形成、抗炎、抗氧化等。而丁苯酞通過NLRP3炎性小體信號通路對腦缺血再灌注的影響報道較少。本研究旨在將不同劑量的丁苯酞作用于大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，通過行神經(jīng)功能缺損評分、測定腦梗死體積以及蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化法檢測細胞焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、NLRP3、白細胞介素-1(IL-1)的表達來探究丁苯酞的神經(jīng)保護機制，為藥物的臨床應(yīng)用以及后續(xù)藥物研發(fā)提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，隨機分籠，大鼠被安置在適宜溫度[(22±3)℃]和濕度[(60±5)%]的房間，按照大鼠標準飼養(yǎng)方式喂養(yǎng)，墊料及鼠糧由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，大鼠自由進食及取水。

1.1.2 實驗試劑及器材 丁苯酞軟膠囊來自石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，caspase-1、NLRP3、IL-1、兔IgG即用型SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Tween80溶液用于溶解丁苯酞軟膠囊，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)顯色劑、蘇木素、伊紅等均由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科提供，0.26 mm魚線購自浙江連球工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 參照Longa等[8]的線栓法建立大腦中動脈閉塞再灌注模型，將50只健康成年雄性SD大鼠隨機分為5組，分別為假手術(shù)組、丁苯酞低劑量治療組、丁苯酞中劑量治療組、丁苯酞高劑量治療組以及模型組，每組10只，各組大鼠均于術(shù)前禁食12 h。稱體重后使用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 mL/kg)，在頸部作正中切口暴露出左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，在CCA處剪一小口，將魚線從頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，感阻力較大時停止繼續(xù)送入，即阻斷血液流向大腦中動脈。假手術(shù)組僅分離血管，治療組與模型組采用線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型。

1.2.2 給藥方法 將0.1 g丁苯酞軟膠囊溶解于0.5%Tween80溶液中，分別配制成5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的丁苯酞混懸液，治療組于缺血1 h后，分別腹腔注射不同濃度的丁苯酞混懸液4 mL/kg，模型組及假手術(shù)組同時注射4 mL/kg的Tween80溶液，于給藥1 h后(缺血2 h)拔出魚線實現(xiàn)缺血再灌注。

1.3 觀察指標

1.3.1 Longa神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組在術(shù)后26 h行Longa評分，丁苯酞不同劑量治療組及模型組在缺血再灌注24 h后行Longa評分。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：爬行時不能伸展右側(cè)肢體；2分：爬行時向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：爬行時向右側(cè)傾倒；4分：大鼠昏迷，不能行走。其中評分1～3分大鼠納入實驗，0分及4分大鼠剔除，同時給予相應(yīng)數(shù)量的補充。

1.3.2 腦梗死體積 每組隨機選取5只評分符合標準的大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉，迅速斷頭取腦，取出后去除嗅球、額極、小腦及低位腦干后放入生理鹽水中浸泡，并置入-20 ℃冰箱中冷凍30 min，取出后以2 mm為間隔行冠狀切片，共切5片，并置于現(xiàn)配的2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyhetrazolium chloride，TTC)溶液中放入37 ℃避光孵箱中靜置30 min，10%甲醛溶液浸泡24 h后取出。正常組織TTC染色為紅色，梗死處TTC染色為白色。染色完成后進行拍照，用圖像分析軟件Image Pro-Plus 6.0計算各腦片梗死面積，并乘以厚度，得出各大鼠的腦梗死體積，并計算得出腦梗死體積百分比。

1.3.3 HE染色觀察細胞學(xué)形態(tài)及免疫組化測定大鼠腦組織中caspase-1、NLRP3、IL-1蛋白表達 將每組余下的5只大鼠腹腔深度麻醉后暴露腹腔及胸腔，剪開右心耳，用9號輸液器針頭扎入左心室并迅速注入150～200 mL生理鹽水，直至觀察到肝臟呈蒼白透明狀及右心耳流出液體為無色透明，即刻注入200 mL 4%多聚甲醛溶液進行內(nèi)固定，至大鼠軀體及肢體僵硬?？焖贁囝^取腦，洗凈表面血漬后浸泡于10%甲醛溶液中4 ℃外固定24 h。取視交叉前后2 mm腦組織行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。包埋后行連續(xù)冠狀切片，切片厚度約2 μm再烤干，按規(guī)定于二甲苯溶液及不同濃度酒精中脫蠟后分別進行HE染色及免疫組化測定。HE染色使用全自動HE染色機，封片后于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。測定海馬組織中caspase-1、NLRP3、IL-1的表達，免疫組化試劑依照說明書調(diào)配至合適濃度，步驟如下：抗原修復(fù)→5%BSA封閉液封閉→滴加一抗→滴加二抗→顯色→核復(fù)染→封片，將玻片置于400倍普通光學(xué)顯微鏡下，細胞核呈棕黃色或有棕黃色顆粒沉積為陽性細胞。于大鼠左側(cè)缺血組織處選取5個400倍鏡下非重疊視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 實驗?zāi)Ｐ驮u估 目前Longa線栓法是制造大鼠腦缺血再灌注損傷模型最常見方法之一，但由于實踐經(jīng)驗不足，致一部分大鼠造模失敗。其中1只死于過度麻醉，2只未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，均給予相應(yīng)數(shù)量大鼠補充。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能基本正常，Longa評分為0分，其余4組均不同程度出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，表現(xiàn)為右側(cè)肢體不能伸展、行走向右側(cè)旋轉(zhuǎn)、行走向右側(cè)傾倒等。與模型組相比，丁苯酞低劑量治療組、中劑量治療組與高劑量治療組大鼠的神經(jīng)功能均改善(P<0.05)，且丁苯酞中、高劑量治療組大鼠神經(jīng)功能的改善優(yōu)于低劑量治療組(P<0.05)，中、高劑量治療組間神經(jīng)功能改善差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s) 單位：分

與模型組比較，①P<0.05；與丁苯酞低劑量治療組比較，②P<0.05。

2.3 各組大鼠腦梗死體積比較 與模型組比較，丁苯酞低、中、高劑量治療組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05)，且中、高劑量治療組縮小更明顯(P<0.05)，中、高劑量治療組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較(±s) 單位：%

與模型組比較，①P<0.05；與丁苯酞低劑量治療組比較，②P<0.05。

2.4 各組大鼠細胞學(xué)形態(tài)比較 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元排列整齊緊密，細胞大小正常，神經(jīng)結(jié)構(gòu)清晰，細胞膜完整，核膜清晰，胞質(zhì)均質(zhì)染色；模型組梗死區(qū)域出現(xiàn)大量壞死神經(jīng)元，神經(jīng)元細胞減少，結(jié)構(gòu)破壞，細胞膜破裂，核膜消失，胞質(zhì)染色變淺等；丁苯酞治療組均出現(xiàn)上述表現(xiàn)，但較模型組程度輕，且中、高劑量治療組較低劑量治療組程度更輕。

2.5 各組大鼠腦組織中caspase-1、NLRP3、IL-1蛋白表達水平比較 連續(xù)400倍視野觀察25個圖片取平均值來計算焦亡的陽性細胞數(shù)。caspase-1蛋白在假手術(shù)組表達最少，在模型組表達最多，丁苯酞低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組表達高于假手術(shù)組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)，丁苯酞中、高劑量治療組表達低于丁苯酞低劑量治療組(P<0.05)，丁苯酞中、高劑量治療組間蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NLRP3蛋白在假手術(shù)組表達最少，在模型組表達最多，丁苯酞低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組蛋白表達高于假手術(shù)組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)，丁苯酞中、高劑量治療組蛋白表達低于丁苯酞低劑量治療組(P<0.05)，丁苯酞中、高劑量治療組間蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-1蛋白表達，與假手術(shù)組相比，模型組陽性細胞數(shù)明顯增多；與模型組相比，丁苯酞治療組陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，而丁苯酞中劑量治療組、高劑量治療組表達低于丁苯酞低劑量治療組(P<0.05)，丁苯酞中、高劑量治療組間蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

組別只數(shù)caspase-1陽性細胞數(shù)NLRP3陽性細胞數(shù)IL-1陽性細胞數(shù)假手術(shù)組50.88±0.832.56±1.042.72±0.84丁苯酞低劑量治療組56.04±1.02①②10.84±1.07①②8.04±0.68①②丁苯酞中劑量治療組54.24±0.83①②③7.20±0.76①②③4.76±0.60①②③丁苯酞高劑量治療組53.84±0.80①②③7.04±0.74①②③4.44±0.51①②③模型組510.16±1.43 14.96±1.2112.48±0.87

與假手術(shù)組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與丁苯酞低劑量治療組比較，③P<0.05。

3 討 論

隨著近年來對缺血性腦卒中動靜脈溶栓及血管內(nèi)介入治療的開展，早期積極進行血管再通、挽救缺血半暗帶備受關(guān)注，而缺血再灌注也受到越來越多的重視，缺血再灌注損傷是一個極為復(fù)雜的病理生理過程，其特征是受損腦組織區(qū)域細胞因子、趨化因子和炎癥因子增多。現(xiàn)已有研究證實，在腦缺血再灌注損傷過程中，過量的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細胞凋亡、壞死、自噬和炎癥反應(yīng)，是腦缺血再灌注損傷的機制[9]。當發(fā)生腦缺血再灌注損傷時，激活的損傷信號通路通過降低損傷和顯著抑制白細胞或炎癥介質(zhì)來促進細胞存活，以減少缺血再灌注損傷[10]。因此，炎癥在腦缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)中起著至關(guān)重要的作用。NLRP3炎性小體作為炎癥反應(yīng)的介質(zhì)，與許多非生物危險信號有關(guān)，包括葡萄糖、活性氧(ROS)等，這些非生物危險信號可誘導(dǎo)非細菌性炎癥反應(yīng)[11-13]。

NLRP3由3個不同的結(jié)構(gòu)域組成：N-端caspase酶激活和募集結(jié)構(gòu)域(CARD)或PYD效應(yīng)結(jié)構(gòu)域、中央核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域(NACHT)、C-端亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRRs)[14-15]。NLRP3在受到來自外界或是細胞內(nèi)的危險信號后，NLRP3的LRR與其配體結(jié)合后使無活性狀態(tài)的NLRP3產(chǎn)生構(gòu)想變化，顯露出NACHT結(jié)構(gòu)域，通過腺苷三磷酸(ATP)聚合形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚體，NLRP3通過氨基端的PYD與銜接蛋白(ASC)的PYD結(jié)合，同時ASC的CARD和caspase-1的CARD結(jié)合，以此形成NLRP3炎性小體從而激活caspase-1。Caspase-1介導(dǎo)白細胞介素-1β(IL-1β)前體裂解成具有活性的IL-1β，IL-1β能募集、激活其他免疫細胞，誘導(dǎo)趨化因子、炎癥因子等的合成，放大炎癥反應(yīng)，如同發(fā)生級聯(lián)效應(yīng)，最終引起細胞焦亡[16-17]。與其他細胞死亡方法相比，細胞焦亡具有獨有的特征，包括caspase-1的激活、膜孔的形成和細胞內(nèi)容物的滲漏[18-19]。細胞焦亡可導(dǎo)致炎癥細胞因子釋放，與凋亡(包括DNA碎裂和核濃縮、形成凋亡小體)和壞死(如質(zhì)膜完整性喪失和細胞內(nèi)物質(zhì)釋放)[20]有共同的特點。丁苯酞作為我國自主研發(fā)的藥物，能夠促使缺血性腦卒中后側(cè)支血管的形成，從而改善腦組織能量代謝、清除自由基、抑制腦組織神經(jīng)元凋亡和保護神經(jīng)等[21]。

本研究證實了NLRP3炎性小體活化誘導(dǎo)的細胞焦亡途徑在大鼠腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，包括caspase-1、NLRP3、IL-1β表達增加，細胞質(zhì)腫脹，炎癥因子釋放，加劇了腦缺血再灌注損傷。同時本研究結(jié)果還表明，不同劑量丁苯酞可通過NLRP3炎性小體信號通路抑制細胞焦亡，改善腦缺血再灌注損傷，且治療效果呈劑量依賴趨勢，即丁苯酞中、高劑量治療組梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分、組織形態(tài)學(xué)、焦亡陽性細胞數(shù)方面都優(yōu)于低劑量治療組。提示NLRP3炎性小體激活及其誘導(dǎo)的caspase-1依賴性細胞焦亡是腦缺血再灌注損傷的新機制，其信號通路可為治療缺血性腦卒中提供新的治療靶點。然而，本研究仍有一些不足之處，還需進一步研究特異性炎癥抑制劑和NLRP3基因敲除或沉默在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用，以驗證NLRP3炎癥小體的特異性作用；再進一步研究NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷的上游信號通路也是下一步研究方向。