急性心肌梗死合并心力衰竭病人血清miR-210表達與cTnI、BNP及預后的相關性

王 寅，徐穎杰，葉永剛

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)屬于臨床常見心血管疾病之一，AMI發病率、死亡率極高，部分病人在住院期間會并發心力衰竭(heart failure，HF)，調查顯示AMI后HF的發生率達30%，死亡率達20%[1]，因此，及時診斷并控制AMI發展對于延長病人生存期、改善病人預后十分重要。以往研究顯示肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)等血清生物標志物廣泛用于AMI、HF臨床診斷，但由于假陽性率較高，臨床應用受限[2]，因此，尋找高效生物學標志物十分重要。微小RNA(micro RNA，miRNA)在心肌組織中的異常表達與各種心臟疾病的發生密切相關[3]。另外，miRNA在外周血表達非常穩定、易獲取，可作為心臟疾病診斷的潛在生物標志物。本研究旨在探討miR-210是否可以作為AMI合并HF診斷、預后的新型生物標志物，以期為AMI疾病的診斷、治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年5月—2015年4月在我院治療的92例AMI病人及85例AMI合并HF病人，納入標準：①AMI病人經實驗室診斷及冠狀動脈造影檢測等符合歐洲心臟病學會(ESC)頒布的第三版急性心肌梗死全球定義(2012版本)[4]；②AMI合并HF病人符合ESC頒布的第三版急性心肌梗死全球定義及急慢性心力衰竭診療指南[5]；③年齡18～78歲；④AMI合并HF者心功能Killip分級2～4級；⑤病人知情同意。排除標準：①川崎病、冠狀動脈疾病等導致AMI；②瓣膜型心臟病、病毒心肌炎、心絞痛等導致的AMI；③既往接受過外科搭橋手術治療；④肝腎功能嚴重受損；⑤腦血管、腫瘤病人。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 病人入院后記錄年齡、性別，并測量心率、血壓、血脂，統計發病常見危險因素如高血壓、糖尿病、是否吸煙、AMI家族史等；同時采用Sonoline G50多普勒超聲檢測儀(德國西門子)檢測左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)值。

1.2.2 血清樣本收集 所有受試者入院后次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內，3 000 r/min離心5 min后，收集上清置于-20 ℃保存。

1.2.3 血清cTnI檢測 采用膠體金法檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)檢測血清cTnI水平，于25 ℃下進行操作，取出檢測卡放置水平位置并標記，滴加4滴待測樣本，以垂直方向滴加于加樣處，待T線處出現紫紅色條帶，采用標準比色卡對結果進行定量分析，檢測范圍1～50 ng/mL。

1.2.4 血清B型利鈉肽(b-type natriuretic peptide，BNP)檢測 采用酶聯免疫法檢測血清BNP水平，根據酶聯免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所)操作：在酶標包被板設定空白孔、標準孔、待測樣品孔，分別添加100 μL樣品稀釋液、標準品、待測樣品，封膜后在37 ℃環境中孵育2 h，洗滌、甩干后，先添加100 μL顯色液A，封膜后37 ℃溫育1 h，棄去孔內液體，甩干，洗滌、甩干后，添加顯色液100 μL B工作液，37 ℃溫育1 h，棄去孔內液體，甩干，洗板，每孔添加50 μL底物溶液，覆膜37 ℃避光顯色20 min，添加終止液終止反應，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。繪制標準品曲線計算樣品濃度。

1.2.5 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測血清miR-210表達 采用miRNA提取試劑盒(Applied Biosystems，美國)，根據說明書提取RNA，并逆轉錄為cDNA，采用qRT-PCR反應試劑盒(Taraka，日本)進行擴增反應，反應體系：2×miRNA SYBR Premix 10 μL，cDNA 樣品1 μL，Forward及Reverse引物分別0.6 μL，補充無核酸酶水至20 μL。于PCR儀(Bio-Rad，美國)進行擴增反應，擴增程序設定：94 ℃預變性 2 min，1個循環；94 ℃變性 20 s，60 ℃退火 35 s，40個循環。每個樣本設定3個重復，反應結束后，以U6作為內部參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-210相對表達量變化。

1.2.6 隨訪 病人均進行36個月隨訪，截止日期為2018年4月30日，采用復診或電話方式進行隨訪，統計病人死亡人數。

1.3 診斷標準 AMI的診斷標準為：①缺血性胸痛持續時間>30 min，且服用硝酸甘油藥物后不能緩解；②心電圖改變：2個相鄰ST段抬高>0.1 mV；③血清學標志物如心肌肌鈣蛋白、肌酸激酶水平升高1倍以上；④冠狀動脈造影發現冠狀動脈分支存在血管病變。HF診斷標準：①病人出現呼吸困難及疲勞等典型臨床表現；②肺部1/3以上部分出現濕啰音；③影像學發現肺阻塞、肺水腫；④不正常水平的腦鈉肽。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 AMI合并HF組AMI病史比例、CK-MB水平均高于AMI組，LVEF低于AMI組，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組年齡、性別、高血壓、糖尿病、心率、血壓、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)等方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 AMI組與AMI合并HF組臨床資料比較

注：1 mmHg=0.133 kPa。SBP為收縮壓；DBP 為舒張壓；LDL 為低密度脂蛋白；WBC為白細胞計數。

2.2 兩組血清miR-210、cTnl、BNP水平比較 AMI合并HF組血清miR-210、cTnl、BNP水平均高于AMI組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

組別例數miR-210cTnl(ng/mL)BNP(pg/mL)AMI組 921.05±0.340.67±0.120.63±0.12 AMI合并HF組 85 1.73±0.482.33±0.641.44±0.26t值-10.940-24.423-25.624P 0.000 0.000 0.000

2.3 miR-210與cTnl、BNP相關性分析 Pearson相關性分析顯示，miR-210與cTnl呈正相關(r=0.365，P=0.000)；與BNP呈正相關(r=0.304，P=0.000)。詳見圖1、圖2。

圖1 血清miR-210與cTnl的相關性分析

圖2 血清miR-210與BNP的相關性分析

2.4 影響AMI病人發生HF的多因素分析 以AMI合并HF作為因變量，將單因素分析中差異有統計學意義的AMI病史、miR-210、cTnl、BNP、LVEF、CK-MB作為自變量進行Logistic多因素回歸分析，結果顯示，AMI病史、miR-210、cTnl、BNP為AMI合并HF的危險因素。詳見表3。

表3 AMI病人發生HF的Logistic多因素回歸分析

2.5 miR-210對AMI合并HF的診斷價值 ROC分析發現，miR-210對AMI合并HF、AMI具有一定的區分能力，miR-210診斷AMI合并HF的AUC為0.850(95%CI0.813～0.914)，約登指數為0.667，臨界值為1.357，診斷敏感性為77.65%，特異性為89.13%。詳見圖3。

圖3miR-210在AMI合并HF診斷中的ROC分析

2.6 miR-210與AMI合并HF預后的關系 病人均隨訪3年，共死亡18例，存活率為78.82%。根據血清miR-210中位值，將病人分為miR-210高表達組、miR-210低表達組，其中miR-210高表達組39例，死亡12例，存活率為69.23%；miR-210低表達組46例，死亡6例，存活率為86.96%；miR-210低表達組存活率高于miR-210高表達組，差異有統計學意義(χ2=3.973，P=0.046)。詳見圖4。

圖4 miR-210預后生存曲線分析圖

3 討 論

AMI合并HF是臨床上常見的心腦血管疾病，其發病驟然、病情進展迅速、死亡率較高，嚴重威脅人類健康[6]。盡早診斷采取合適的治療對改善AMI合并HF病人預后十分重要。臨床研究表明，AMI合并HF發病早期并無臨床特異表現，僅有部分病人心電圖顯示異常[7]。cTnI作為AMI及HF診斷常用的血清學標志物，雖診斷敏感性較高，但在其他疾病如急性或慢性腎衰竭病人中也可檢測到肌鈣蛋白T(cTnT)水平的升高[8]，特異度較低。因此，探尋高效的血清標志物對AMI合并HF的臨床診斷具有重要價值。

miRNA為非編碼RNA分子，長度為21～25 nt，通過靶向結合靶基因mRNA的3′UTR進而抑制靶基因的轉錄，從而降低其靶基因表達水平[9]。研究證實，miRNA的異常表達與AMI、HF等多種心血管疾病的發生有關，為發病機制中的重要調控基因[10]。一般情況下miRNA在血清中表達較穩定，容易檢測，且miRNA具有組織特異性，血清miRNA的水平也具有差異。基于以上優點，血清miRNA可能成為疾病診斷及預后判定的生物學標志物。然而，關于AMI合并HF病人中外周血miRNA研究不多。

miR-210在心肌系統缺氧缺血調控中發揮重要作用。有研究顯示，冠心病病人心肌長期血流供應不足，導致心肌缺氧，隨著時間的延長，心肌細胞數量降低后，心功能發生障礙，導致心力衰竭[11]。在細胞缺氧缺血后，miR-210水平均升高，在多個miRNA異常表達中最顯著[12]。此外還有研究證實，miR-210在缺氧后可能受到缺氧誘導因子(HIF)的誘導后水平升高，故可反映缺氧程度[13]。有研究顯示，HF模型大鼠miR-451與miR-210水平均明顯升高[14]。Zhao等[15]通過對比心力衰竭組、健康組、胎兒組血清miR-210水平發現，心力衰竭組血清miR-210水平顯著升高，且與胎兒組比較差異無統計學意義。以上研究均提示，血清miR-210水平的異常表達與心力衰竭的發生有關，然而在AMI合并HF中的表達情況，目前尚不明確。本研究發現，與AMI組相比，AMI合并HF組血清miR-210水平顯著升高，與以往研究相符，提示miR-210可能參與AMI合并HF的發生。

BNP為心室肌細胞分泌的短肽激素，研究證實AMI發生后，利鈉肽系統被激活導致血清中BNP水平均顯著升高[16]。多項研究證實BNP水平與HF病人病情嚴重程度有關，且高水平BNP預示HF病人預后不佳[17]。本研究發現AMI合并HF病人血清BNP水平明顯升高，且與miR-210呈正相關，由此推測miR-210可能參與AMI合并HF的發生發展過程。HF發生后，心肌細胞通透性增強，細胞質內游離cTnI進入血液中，導致其水平升高，且其水平的持續升高會破壞心肌細胞結構，因此，cTnI水平可反映心肌損傷及病情程度[18]。本研究發現AMI合并HF病人血清cTnI水平明顯升高，且與miR-210呈正相關，由此推測miR-210可能與AMI合并HF病情有關。

為進一步明確miR-210與AMI合并HF發生的關系，本研究采用Logistic多因素回歸分析，發現miR-210為AMI合并HF發生的獨立危險因素。基于miR-210在AMI病人、AMI合并HF病人中的表達差異，可能成為AMI合并HF發生的預測靶點，可能對AMI合并HF具有潛在的診斷價值。本研究采用ROC曲線分析顯示，miR-210診斷AMI合并HF的AUC值為0.850(95%CI0.813～0.914)，約登指數為0.667，臨界值為1.357，診斷敏感性為77.65%，特異性為89.13%，提示血清miR-210對AMI合并HF具有一定的預測價值。

越來越多的研究顯示，miRNA可對心臟疾病預后進行評估。血漿hsa-miR-30a升高是高血壓左室肥厚病人預后不良的獨立預測因子[19]。AMI病人血清miR-1水平較低者術后恢復較好。符雅菁等[20]研究顯示，AMI病人血清中miR-214水平與冠狀動脈狹窄范圍及預后有關。本研究經過KM生存曲線分析發現miR-210高表達者3年生存率低于低表達者，提示miR-210高表達者病情嚴重，預后不佳。

綜上所述，血清miR-210水平在AMI合并HF病人中升高，與BNP、cTnI相關，且為AMI合并HF發生的獨立危險因素，與病人不良預后有關。但是，由于AMI合并HF發生機制較復雜，本研究僅從臨床角度探究其表達意義，而關于分子機制缺乏相關研究，因此，仍然需要繼續深入的研究，為AMI合并HF的預防和治療提供新的依據。