豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化

王豕辰，孫 彤，董 恒，侯曉林

（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

豬偽狂犬病是一種皰疹病毒性疾病，是導(dǎo)致豬繁殖失敗并給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失的主要病原體之一[1]。其特征在于妊娠母豬流產(chǎn)，公豬不育等。豬偽狂犬病不易與豬瘟、細(xì)小病毒感染等病區(qū)別開(kāi)，需要實(shí)驗(yàn)室檢查確診[2]。核酸研究方法在許多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，為了提高PCR的檢測(cè)準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化并且檢測(cè)了特異性。

1 材料與方法

1.1 材料

豬腎細(xì)胞PV-15為實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株；偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒Ⅰ型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）均為實(shí)驗(yàn)室保存毒株；DMEM高糖培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清(FBS)；青鏈霉素和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自上海生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)毒

調(diào)整PV-15細(xì)胞個(gè)數(shù)為1h106個(gè)/mL接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每次1 min，接毒量為10TCID50，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)1 h，吸棄病毒，PBS清洗兩次，每次1 min，加入含3%血清的培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)。采用反復(fù)凍融法破裂細(xì)胞，-20 ℃反復(fù)凍融3次后，將細(xì)胞瓶?jī)?nèi)液體全部轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中于600 g離心5 min，收集上清（病毒液），置于-80 ℃保存。

1.2.2 病毒DNA提取

此過(guò)程根據(jù)試劑盒提供說(shuō)明書進(jìn)行操作。向干凈的1.5 mL離心管中加入20μL Prteinase K然后加入200μL病毒液，再加入200μL Carrier RNA工作液（緩沖溶液GB:Carrier RNA=1 100:31比例配置）。蓋緊管蓋置于渦旋振蕩機(jī)上震蕩15 s使管內(nèi)溶液充分混合。將離心管置于56 ℃恒溫水浴鍋中孵育15 min后短暫離心15 s。向管中加入250μL無(wú)水乙醇，渦旋振蕩機(jī)上震蕩15 s，然后靜置5 min后短暫離心15 s。將離心管中所有液體全部轉(zhuǎn)移至RNase-Free吸附柱CR2上后，6 000 g離心1 min。500μL溶液GD洗滌一次，然后600μL溶液PW洗滌2次，洗滌離心條件同上。洗滌后向管中加入500μL乙醇，13 000 g離心3 min，然后小心打開(kāi)吸附柱的蓋子，室溫放置1 min，使吸附膜的完全變干后，加入100μL RNase-Free ddH2O，蓋緊管蓋，靜置5 min后，13 000 g離心1 min，收集洗脫液（含有病毒DNA），-80 ℃保存。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

偽狂犬病毒引物使用根據(jù)國(guó)標(biāo)方法，擴(kuò)增偽狂犬病毒基因中434-651堿基對(duì)（bp）之間217bp基因片段，由生工生物（上海）股份有限公司合成，其序列為：

P1：5?-CAGGAGGACGAGC TGGGGCT-3’；

P2：5?-GTCCACGCCCCGCT TGAAGCT-3’。

1.2.4 PCR條件的優(yōu)化

此過(guò)程根據(jù)試劑盒提供說(shuō)明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)室PCR反應(yīng)采用25μL反應(yīng)體系，加入PCR MIX 2.5μL，F(xiàn)ORWARD PRIMER(10 mmol/L) 12.5μL，REVERSE PRIMER(10 mmol/l)0.1μL，DNA 模 板 0.1μL，ddH2O添加至25μL。調(diào)整擴(kuò)增各參數(shù)進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。

1.2.5 PCR特異性試驗(yàn)

利用優(yōu)化后的條件對(duì)PRV、PPV、PCV1和PCV2分 別 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，以鑒定其特異性。

1.2.6 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。電泳緩沖液為1xTAE，電壓為220 V，反應(yīng)時(shí)間為35 min。電泳反應(yīng)結(jié)束后，立即使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)品進(jìn)行照相記錄并分析擴(kuò)增產(chǎn)物帶。

2 結(jié)果

2.1 PRV PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)擴(kuò)增各參數(shù)多次進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示，當(dāng)退火溫度為62.5 ℃至63.5 ℃時(shí)，在217 bp處出現(xiàn)明細(xì)的擴(kuò)增片段，且無(wú)雜帶，擴(kuò)增效果最佳。94 ℃ 3 min變性，94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

2.2 PRV PCR特異性結(jié)果

采用優(yōu)化過(guò)的PCR方法對(duì)PRV、PPV、PCV1和PCV2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，只有PRV在217bp處出現(xiàn)擴(kuò)增片段，而PPV、PCV1和PCV2均未出現(xiàn)擴(kuò)增片段。

圖1 不同擴(kuò)增參數(shù)對(duì)PRV PCR的影響

圖2 PRV PCR特異性檢測(cè)電泳圖

3 討論

近年來(lái)，病毒性疾病已成為現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要威脅。尤其是由PRV等引起的呼吸和生殖系統(tǒng)疾病越來(lái)越普遍，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。由于發(fā)病豬臨床癥狀與豬細(xì)小病毒，豬瘟病毒等感染相似，所以必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)后才可以確診[4]。因此建立一個(gè)特異檢測(cè)PRV的方法是十分必要的。

在實(shí)踐中，PCR可能由于各種原因而失敗，其中引物的非特異性結(jié)合是比較常見(jiàn)的[5]。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多技術(shù)和程序來(lái)優(yōu)化PCR條件。退火是PCR中關(guān)鍵的一步，是引物與DNA鏈的結(jié)合。退火的溫度對(duì)PCR的特異性有巨大影響[6]。退火的溫度需要從多方面去決定，一般是根據(jù)引物的最適溫度（Tm）值來(lái)設(shè)計(jì)溫度以便保證擴(kuò)增效果達(dá)到理想[7]。此實(shí)驗(yàn)中根據(jù)引物Tm值選擇了16個(gè)退火溫度，通過(guò)電泳檢測(cè)到當(dāng)退火溫度介于62.5 ℃至63.5 ℃之間時(shí)，目的基因片段擴(kuò)增明顯且沒(méi)有雜帶，并且通過(guò)特異性檢測(cè)證實(shí)該反應(yīng)條件下，只有PRV目的基因可以擴(kuò)增，PPV、PCV1和PCV2均呈現(xiàn)陰性。

總之，PCR是快速、特異的檢測(cè)PRV感染的技術(shù)，實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化方法可以為今后實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PRV提供一種新的參考。