豬場生物安全疾病檢測方法探討

呂莫然，劉 爵

（1.北京農學院，北京 昌平 102206；2.北京農林科學院，北京 海淀 100097）

隨著非洲豬瘟的暴發和生物技術的不斷發展，養殖業的生物安全問題愈發突出。養殖場在建設時，要特別注意所選的建設場地，規劃好合理的豬場結構和布局，完善配套的設施設備并注意及時改進，要有合理的生物安全體系，工作人員也要嚴格執行生物安全制度，進出豬場要嚴格消毒，對病豬死豬的處理也要按國家相關規定，進行無害化處理[1]。生物安全按方法實施的對象，可以分為外部防御和內部控制。外部生物安全防御主要是對養殖場的外來病原體進行控制，防止其進入，主要措施是加強外來人員的清洗消毒；內部生物安全是對養殖場內的病原體進行控制，防止其在養殖場內傳播[2]。因此，及時發現養殖場內的病原體對內部生物安全的管理具有重要作用。目前實驗室最常用的檢測方法是PCR檢測，此項研究通過實際操作實驗中對臨床樣本流行性疾病豬圓環病毒3型的檢測以及檢測方法的優化來建立和完善生物安全體系進行建議指導。

1 材料與方法

1.1 材料

所用毒株以及臨床樣品均保存在實驗室；病毒基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen生物技術公司；PCR反應試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒和臨床樣品的DNA提取

實驗前先將水浴鍋預熱至56℃，緩沖液AL和ATL如果有沉淀要重新溶解，分別在緩沖液AW1和AW2中加入適量96%～100%的無水乙醇使之達到工作濃度。將樣品粉碎在2 ml離心管中使用200 μl的PBS渦旋混合，加入20 μl的蛋白酶K，振蕩混勻。混合200 μl AL緩沖液，震蕩混勻之后放入預先加熱好的56 ℃ 水浴鍋中，溫水浴10 min。向離心管中加入200 μl無水乙醇，振蕩混勻。將上述液體用移液槍轉移到DNeasy mini濾柱中，靜止1 min，至少8 000hg離心大約1 min，棄去濾出液。將濾柱重新放入新的2 ml離心管，加入500 μl的緩沖液AW1混勻，8 000hg離心 1 min，棄去濾出液。將濾柱置于新的2 ml離心管，加入 500 μl的緩沖液AW2混勻，靜止1 min，至少20 000hg離心大約3 min，棄去濾出液。將濾柱重新放入新的 2 ml離心管或1.5 ml離心管，在濾柱中間加入200 μl核酸酶的水，室溫靜置一會兒，6 000hg離心2 min。

1.2.2 引物的設計與合成

根據PCV 3全序列（MF155643.1），借助生物工具軟件Primier 5在引物設計原則的基礎上，設計兩種進行普通PCR的特異性引物并送公司進行合成。其序列為：

P1：5? -GTTACCCAACTGTG CCCATCTATG-3’；

P2：5? -GTCACGCACAATTT CTCTCTCGG-3’。

1.2.3 實驗室臨床樣品的檢測

根據優化后的檢測方法，對實驗室臨床樣品進行檢測，此過程根據試劑盒提供的說明書進行實驗操作，PCR擴增檢測實驗采用25 μL反應體系，加入PCR mix 2.5 μL，forward primer(10 mmol/L) 12.5 μL，reverse primer(10 mmol/l) 0.1 μL，DNA 模板 0.1 μL，ddH2O 添加至25 μL。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增反應產物。電泳緩沖液為1xTAE，電壓為220 V，反應時間為10 min。使用紫外線照相儀對結果進行記錄。

2 結果

2.1 PCV3 PCR反應條件優化結果

經過對擴增各參數多次的優化，對實驗設計的引物進行特異性檢測，結果如圖1所示，只有特定檢測的病毒有條帶，表明病原體檢測的方法具有高度特異性。

M：DL 2000 Maker；1：豬圓環病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）2：豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）3：豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）4：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）5：豬流行腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）6：豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）7：豬 瘟 病 毒（Classical swine fever virus，CSFV）8：豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）9：豬圓環病毒1型（Porcine circovirus type 1，PCV1）

2.2 臨床病料檢測的結果

利用優化好的聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法，將實驗室2018年之前和2019年在各省豬場收集的病料進行檢測。樣本包括心、肝、脾、肺、腎等臟器和支氣管淋巴結、腸系淋巴結、腹股溝淋巴結、肺淋巴結等。檢測結果可以反映豬場內部生物安全的管理效果，如表1所示。

3 討論

近年來，隨著流行性疾病的頻繁暴發，豬場生物安全的內部控制變得愈發重要。一些傳染病由于沒有及時被檢測出來，在豬群中快速傳播，給養豬業帶來了巨大的經濟損失。因此建立靈敏特異的檢測方法對完善生物安全體系具有重要作用。

圖1 設計引物的特異性實驗

表1 臨床病料的檢測結果

此次用于指導生物安全生產的是豬圓環病毒的一種基因型，豬感染后會引起斷奶后多系統衰竭綜合征、腎病、皮膚及內臟的炎癥反應。感染母豬難以受孕，流產率上升，還會生產出弱胎、死胎、畸形胎甚至木乃伊胎。豬圓環病毒3型常常與豬圓環病毒2型、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒等形成混合或繼發感染，僅僅根據臨床癥狀和病理變化難以做出正確的判斷。而電鏡觀察最直接，也最常規，是將病豬的組織制成切片在電鏡下觀察，但這種方法步驟繁瑣，需要大量的時間和精力。原位雜交技術檢測是使用探針與組織、細胞或染色體上待測單鏈DNA或RNA形成專一的核酸雜交分子，再經特殊方法檢測出來；但目前這種方法在國內應用于檢測豬圓環病毒不多見，操作也較為復雜，特異性不高。新興起的LAMP（環介導恒溫擴增技術）是指在設計好引物之后，在恒溫水浴鍋內進行基因的擴增，花費時間短，也無需特殊實驗儀器，靈敏度比PCR也高，但在實際操作中，容易被氣溶膠污染產生假陽性。ELISA檢測方法是利用抗原或抗體的相互作用與酶進行連接，再與底物作用[3-6]；該種方法特異性和敏感性都比較高，缺點是檢測過程中需要精密儀器（酶標儀），除此之外，使用該方法檢測的試劑盒價格較高。IFA（間接免疫熒光）和IPMA（免疫過氧化物酶單層細胞實驗）兩種檢測方法相似，主要區別是最后的觀察，IFA依靠熒光觀察，IPMA依靠酶進行顯色反應觀察。兩者都需要精密的儀器，而且，IFA實驗結果存在非特異性染色。綜合來說，實驗室大多數檢測操作復雜，花費時間較長，專業性要求較高。PCR（聚合酶鏈反應）因其操作簡便成為實驗室應用最廣泛的檢測方法，實驗需要設計出特異性較高的引物，以堿基互補配對為原則，在模板和引物的指導下，通過DNA聚合酶擴增出新鏈。

在對豬場內部進行生物安全管理時，要嚴格執行消毒制度，加強管理；科學飼養，提高豬群免疫力，加強保健意識。及時對豬群進行疾病檢測，減少病毒感染擴散[7]。