豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)標準與規(guī)范及相關(guān)問題解讀

張樹山，張德福*，韓雪峻，姜紅菊

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3.上海祥欣畜禽有限公司/上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 2013021）

1 背景

優(yōu)秀種公豬在豬育種和生豬商品化生產(chǎn)中的作用至關(guān)重要，而豬冷凍精液保存技術(shù)正是讓其實現(xiàn)種用價值倍增的有效手段之一。然而，與牛精液相比，豬精液量大、精子對“冷休克”較敏感等特性，多年來一直制約著豬精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。此外，作為多胎家畜，豬冷凍精液使用效果的評價指標除受胎率外還有窩產(chǎn)仔數(shù)，這也是豬冷凍精液推廣應(yīng)用難度較大的原因。近10年來，研究者們已摸索出一套針對豬精液和精子特性的冷凍工藝，在冷凍稀釋液研發(fā)方面也取得了較大進展；可精準控制降溫的精子冷凍儀、豬精液自動分裝等儀器的問世和應(yīng)用，結(jié)合母豬深部輸精技術(shù)等，使豬冷凍精液的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用成為可能。

自2009年起，隨著全國性的豬遺傳改良計劃的全面實施，政府通過國家生豬良種補貼項目加強國家生豬核心育種場、種公豬站建設(shè)，有力地推動了國內(nèi)育種和生產(chǎn)企業(yè)單位從種公豬的活體引種，向根據(jù)自身需求訂制種豬精液（液態(tài)保存和冷凍精液）轉(zhuǎn)變。近兩年非洲豬瘟疫情的慘痛教訓(xùn)，使業(yè)內(nèi)人士開始意識到，與引進種公豬和訂制液態(tài)保存精液相比，豬冷凍精液可使種公豬遺傳資源突破時空限制，并具有更高的生物安全性。目前，國內(nèi)多家知名豬育種企業(yè)十分重視冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)和銷售，市場前景十分看好。

“不以規(guī)矩，不成方圓”，出自《孟子》。技術(shù)標準/規(guī)范是一種規(guī)定產(chǎn)品、過程或服務(wù)應(yīng)滿足技術(shù)要求的文件，一般認為規(guī)范的強制性弱于標準。技術(shù)標準的制訂已經(jīng)成為產(chǎn)業(yè)特別是高技術(shù)產(chǎn)業(yè)競爭的制高點。當(dāng)今知識經(jīng)濟時代，在一些高技術(shù)產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域已由過去的“先有產(chǎn)品后有標準”向“標準先行”轉(zhuǎn)變。在家畜冷凍精液中，牛冷凍精液是最早實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)和銷售的，我國至今已有4個國家和地方標準。豬冷凍精液標準化的商業(yè)生產(chǎn)也應(yīng)有生產(chǎn)標準來規(guī)范，但目前能公開檢索到的相關(guān)生產(chǎn)技術(shù)標準僅有一個（DB13/T 2633-2017 豬冷凍精液，河北?。?。文章對公開發(fā)表和正在修訂的2個豬冷凍精液生產(chǎn)標準/規(guī)范（種豬冷凍精液，國家標準，修訂中；豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范，上海市，修訂中）逐條進行解讀和探討，以期為相關(guān)管理和生產(chǎn)人員能更好地學(xué)習(xí)和理解生產(chǎn)標準，從而推動豬冷凍精液的商業(yè)化進程。同時，標準修訂者也能從生產(chǎn)一線人員及時得到反饋意見，以便進一步提高標準的先進性、科學(xué)性、合理性和可操作性。

2 豬凍精制作標準與規(guī)范要點梳理與解讀

2.1 使用范圍

文章涉及的3個標準/規(guī)范主要針對種豬冷凍精液的商業(yè)化生產(chǎn)，不適合用于地方豬品種遺傳資源保存。

我國地方豬品種群體規(guī)模較小、甚至部分品種瀕臨滅絕，少量的公豬顯得尤為珍貴，故地方豬品種保種對公豬個體、細管冷凍精液密度、解凍精液品質(zhì)（活力、頂體完整性等）等指標遠低于商業(yè)化凍精的生產(chǎn)。

2.2 相關(guān)術(shù)語（豬精液品質(zhì)檢測指標）

豬精液品質(zhì)檢測指標及相關(guān)術(shù)語如表1。

序號為1～3的指標均可以利用計算機輔助分析（Computer aided sperm analyse，CASA）系統(tǒng)進行檢測。該系統(tǒng)能通過跟蹤精子運動軌跡測定精子運動速率，并自動分析精子活力和活率指標；精子畸形率則由計算機自動識別精子再由人工評定分類，最后分析畸形精子百分率（畸形精子包括頭部、體部和尾部畸形或缺失等）。

精子活力和活率這兩個指標主要用于評價精子運動性能，二者僅有一字之差，容易混淆。目前，業(yè)內(nèi)人士已約定俗成，精子活力指直線運動精子百分率；精子活率指活精子百分率，可以由CASA系統(tǒng)分析（通過判斷精子運動情況）或染色方法鑒定。

高品質(zhì)的豬冷凍精液，意味著解凍后精子具有較好的運動性能（評價指標為精子活力）和頂體完整性。精子活力較高的解凍精液，能夠使部分精子到達受精部位；到達受精部位的精子還需要有較完整的頂體才有較好的穿卵能力（即受精能力）。故精子頂體完整性是評價解凍精子受精能力的一個重要指標。通常采用FITC-PNA染色法在熒光顯微鏡下分析。

2.3 種公豬和原精液要求

種豬來源于具有較好的種用價值，體型外貌和生產(chǎn)性能等符合種用要求、三代系譜資料齊全、體質(zhì)健康，不患有國家或農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已發(fā)布的動物防疫法中所明確的二類疾病的種豬。

由于豬精子耐凍性具有較明顯的個體差異性，通過豬精子耐凍性試驗篩選（即對所有公豬精液進行冷凍，通過檢測其解凍活力、頂體完整性和畸形率等指標評定）的公豬用于制作豬冷凍精液，具有高育種價值的種公豬可降低篩選標準（如解凍后精子活力、精子畸形率和頂體完整性）。

原精液色澤為灰白色或乳白色，精子活力≥70 %，精子密度≥2.0h108個/mL，精子畸形率≤5 %。

表1 相關(guān)術(shù)語和豬精液品質(zhì)檢測指標

2.4 豬冷凍精液質(zhì)量要求

表2為種豬冷凍精液質(zhì)量要求。

解凍后的冷凍細管上的標記應(yīng)該清晰易識別、信息齊全，與小布袋或貯精管上標記一致。將豬解凍精液推入解凍液后，將排空細管與解凍精液一一對應(yīng)、整齊擺放，以便后面信息記錄。

如果解凍過程中有水進入解凍精液，會對精子產(chǎn)生滲透壓損傷，故解凍時發(fā)現(xiàn)細管有破損應(yīng)即棄掉。

豬冷凍精液劑型主要有0.5、1.0和5.0 mL細管三種。普遍認為，細管劑型越大（即體積越大），細管內(nèi)不同部位豬精液冷凍降溫和解凍升溫速率較低且差異越大，精子的冷凍效果不如小劑型。其優(yōu)點是體積大、有效精子數(shù)多，解凍效率相對較高。目前，在豬冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)的精液灌裝、封口等自動化生產(chǎn)設(shè)備絕大多數(shù)是生產(chǎn)0.5 mL劑型的。但0.5 mL劑型的問題是單根細管內(nèi)有效精子數(shù)相對較少，解凍較繁瑣（每頭母豬單次輸精需解凍0.5 mL細管冷凍精液4～8支）。

精子活力，指豬解凍精液在水浴鍋靜置20 min后，利用CASA系統(tǒng)進行分析，取三次檢測均值（允許誤差不能大于均值的5%）。

前向運動精子數(shù)（即有效精子數(shù)目）=細管體積h精液密度h精子活力。

精子畸形率采用姬姆薩染色法，在顯微鏡（400～600倍）下觀察，并用血球分離計數(shù)器計數(shù)，每個抹片觀察200個以上的精子（分左、右2個區(qū)），取2抹片的平均值（變異系數(shù)不得大于20%）。

精子頂體完整率采用FITCPNA熒光染色后，在400h熒光顯微鏡下（激發(fā)波長480 nm、發(fā)射波長530 nm紫外光）觀察并計數(shù)200個以上精子，并統(tǒng)計頂體完整精子數(shù)量并計算百分率（重復(fù)2次，允許誤差不能大于均值的5%）。

細菌含量是家畜冷凍精液的一個重要品質(zhì)指標，對豬冷凍精液的使用效果和母豬生殖系統(tǒng)的健康均有重要影響作用。采用公豬自動采精系統(tǒng)、保持豬冷凍精液生產(chǎn)場地清潔、加強器皿和稀釋液滅菌等均可明顯降低豬冷凍精液中的細菌含量。豬冷凍精液細菌含量檢測，通過對豬解凍精液接菌、培養(yǎng)和細菌菌落計數(shù)，1 mL豬解凍精液中細菌菌落數(shù)量≤1 000個為合格產(chǎn)品。隨著豬精液冷凍技術(shù)的進步，未來的標準修訂會逐步提高精液中的細菌含量標準。

非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、高致病性豬藍耳病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細小病毒和布魯氏菌等7種病毒相關(guān)國家/行業(yè)標準，采用試劑盒的方法檢測（也可采用采精種公豬個體定期檢測結(jié)果），病原學(xué)檢測均為陰性即合格。

上述指標在每批次產(chǎn)品入庫前和銷售前各檢測一次（或每隔半年一次）。

2.5 取樣

2.5.1 生產(chǎn)方取樣

按照GB/T 2828.2，采用極限質(zhì)量LQ=8.0，模式A一次抽樣方案，確定取樣種豬樣品量。

采用極限質(zhì)量LQ=8.0，如表3所示，細管冷凍精液數(shù)量在151～280支時，抽檢28支全部達標即為合格產(chǎn)品；數(shù)量在3 201～10 000支時，抽檢125支，不達標數(shù)量≤5時為合格產(chǎn)品。

2.5.2 質(zhì)量監(jiān)督取樣

按照GB/T 2828.11，該群體種豬為一監(jiān)督總體，采用聲稱質(zhì)量水平（DQL）=10，選用第Ⅰ檢驗水平的抽樣方案，確定取樣種豬樣品量（見表4）。

表2 種豬冷凍精液質(zhì)量要求

聲稱質(zhì)量水平（DQL）=10，若細管冷凍精液數(shù)量在90～100支之間時，取樣數(shù)量為4支；若細管冷凍精液數(shù)量在150～170支之間時，取樣數(shù)量為7支。

2.6 豬冷凍精液細管的包裝和貯存

包裝應(yīng)在液氮或-140℃以下的環(huán)境中進行。將檢驗合格的冷凍細管采用手工或半自動儀器裝入貯精管，包裝后的細管冷凍精液，其棉塞端應(yīng)朝向貯精管的底部。再將裝有豬冷凍精液細管的貯精管移至滅菌紗布袋（一般每個紗布袋裝同1頭公豬的冷凍精液細管），同一天的多個紗布袋的封口繩分別拉緊、用另外一根繩扎在一起后浸入液氮中，棉繩上端貼好標簽拴到液氮罐提手處（圖1、圖2左，即“貯精管 紗布袋 細繩”法）。采用“貯精管 紗布袋 細繩”法的缺點是，不同紗布袋的系繩容易纏到一起不容易取出。種豬冷凍精液應(yīng)貯存于裝有液氮的容器。在由一個容器轉(zhuǎn)移至另一容器時，在空氣中的滯留時間不得超過3 s。

國外也有采用“貯精管 貯精筒 提漏”方法的情況，即將裝滿冷凍細管的貯精管收集至大號貯精筒、移至敞口液氮罐中的提漏中保存（圖2右）。這種保存方法取放、解凍方便，值得有條件的生產(chǎn)企業(yè)借鑒。

保存豬冷凍精液的液氮罐由專人負責(zé)維護和液氮添加，并做好液氮添加記錄。

豬冷凍精液信息標記主要在冷凍細管封口一端（使用細管打印機）、紗布袋上和液氮罐口系繩末端（見圖3。使用記號筆標記、粘貼打印標簽或二維碼）。液氮罐邊放置豬冷凍精液記錄本，記錄生產(chǎn)日期、生產(chǎn)者與質(zhì)檢員姓名、生產(chǎn)廠家地址與聯(lián)系方式、公豬號、液氮罐標號、冷凍細管數(shù)量，移出和移入均有記錄，并將記錄輸入電子數(shù)據(jù)庫。

2.7 豬冷凍精液的運輸

運輸過程中貯存容器不得碰撞或劇烈震動。液氮罐外的明顯位置標記“向上”、“小心輕放”等儲運圖示標志；搬運、裝車時應(yīng)該注意罐體防護，不得傾斜、橫倒、碰撞和強烈振動，確保豬冷凍精液始終浸泡在液氮中；隨罐附帶記錄一份并將電子版發(fā)給客戶。

表3 模式A 一次抽樣方案（主表）

表4 第Ⅰ檢驗水平的抽樣方案表（L=1）

圖1 放置冷凍細管的貯精管（左），用記號筆標明簡單信息；帶有系繩的紗布袋（右）

圖2 國內(nèi)使用的“貯精管—紗布袋—細繩”法（左）和國外使用“貯精管—貯精筒—提漏”法保存細管冷凍精液（右）

圖3 有打印信息的細管（左）；紗布袋系繩末端有彩色打印的標簽，有生產(chǎn)日期、豬耳號等信息（右）

3 展望

豬冷凍精液是繼牛冷凍精液之后第二個實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)和銷售的家畜精液品種，規(guī)?；?、商業(yè)化的生產(chǎn)迫切需要相關(guān)標準來規(guī)范。文章解讀的3個標準/規(guī)范均是由科研院所和生產(chǎn)企業(yè)聯(lián)合制定，并廣泛征求意見和修改，具有較高的先進性、科學(xué)性、合理性和可行性。隨著豬冷凍精液相關(guān)標準相繼頒布，必將發(fā)揮引領(lǐng)和帶動作用，從而推動“豬冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn) 銷售 技術(shù)服務(wù)”這一體系健康、飛速發(fā)展。同時，相關(guān)標準也需要從科研活動、生產(chǎn)、使用等環(huán)節(jié)不斷得到反饋、修訂，尤其要注意借鑒歐盟、美國等畜牧業(yè)發(fā)達國家的先進經(jīng)驗。