電子煙對去內皮SD大鼠腸系膜上動脈收縮的影響

羅先裕 韓寧寧 鄧力芝

摘要：目的 ?探討電子煙代謝產物及其溶劑對去內皮Sprague-Dawley（SD）大鼠腸系膜上動脈（SMA）環收縮反應的影響。方法將溶劑（DMSO）、電子煙氣溶膠提取物（ECAEs）、煙油溶劑[丙二醇（PG）和甘油（VG）]、煙堿體內主要代謝產物[N-亞硝基降煙堿（NNN）和亞硝胺酮（NNK）]、以及電子煙副產物丙烯醛（Acr）分別加入培養基孵育去內皮SD的SMA環24 h，觀察不同濃度5-羥色胺（5-HT，10-10～10-4 mol/L）和苯腎上腺素（PE，10-10～10-4 mol/L）誘導的收縮反應。結果 ?DMSO、ECAEs對SMA環收縮反應無影響;丙二醇使5-HT誘導收縮的pD2值（SMA環收縮效應達到50%的時候所對應的收縮劑的濃度值）與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），甘油使PE（10-9～10-7 ?mol/L）濃度區間的收縮反應減弱（P<0.05）;NNN和NNK在100 μmol/L濃度下均可增強5-HT和PE誘導收縮反應的最大效應值Emax（P<0.05），且PE在10-5～10-4 mol/L劑量范圍內可明顯誘導SMA的收縮;丙烯醛培養的SMA環Emax值與對照組之間均有差異（P<0.01），5-HT和PE在10-5.5～10-4 mol/L劑量范圍內誘導的收縮曲線均顯著左移。結論 ?電子煙各類潛在危害因子24 h短期急性暴露可不同程度的增強去內皮SD大鼠腸系膜上動脈環的收縮反應，增強血管平滑肌的收縮反應。

關鍵詞：電子煙;5-羥色胺;苯腎上腺素;腸系膜上動脈

中圖分類號：TS458;R363 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.019

文章編號：1006-1959（2020）05-0062-05

Abstract：Objective ?To investigate the effects of e-cigarette metabolites and their solvents on the contractile response of the superior mesenteric artery （SMA） ring in deendothelial Sprague-Dawley （SD） rats. Methods ?Solvents （DMSO）， e-cigarette aerosol extracts （ECAEs）， e-liquid solvents [propylene glycol （PG） and glycerol （VG）]， and major metabolites in nicotine [N-nitrosonornicotine （NNN）] And nitrosamine （NNK）] and e-cigarette by-product acrolein （Acr） were added to the culture medium to incubate the SMA ring without SD in the endothelium for 24 h， and different concentrations of 5-HT （5-HT， 10-10～10-4 mol/L） and phenylephrine （PE， 10-10～10-4 mol/L） induced contractile response. Results ?DMSO and ECAEs had no effect on the SMA ring contraction response; the pD2 value of 5-HT induced contraction by propylene glycol （concentration value of the contractile agent when the SMA ring contraction effect reached 50%） was statistically significant compared with the control （P<0.05）， glycerol weakened the contractile response of PE （10-9～10-7 mol/L） concentration range （P<0.05）;Both NNN and NNK can enhance the maximum effect value Emax （P<0.05） of 5-HT and PE-induced contractile responses at a concentration of 100 μmol/L， and PE can be obvious in the range of 10-5～10-4 mol/L Induction of SMA contraction; Emax values of SMA ring cultured in acrolein were different from those in the control group （P<0.01）， and the contraction curves induced by 5-HT and PE at a dose range of 10-5.5 to 10-4 mol/L were both moved significantly to the left. Conclusion ?The short-term acute exposure of various potential hazards of e-cigarettes for 24 h can enhance the contractile response of the superior mesenteric artery ring of de-endothelial SD rats and the contractile response of vascular smooth muscle.

Key words：Electronic cigarette;5-hydroxytryptamine;Phenylephrine;Superior mesenteric artery

電子煙又名電子尼古丁傳送系統，由電池、儲液倉、煙彈和吸嘴組成[1]。通過電池加熱使得煙油高溫霧化吸入人體，以模仿吸食卷煙的過程。霧化產生的氣溶膠化學組成與煙油化學組成不同，包括煙草特有的多環芳烴、亞硝胺、甲醛、乙醛和丙烯醛等有毒化合物的存在[2， 3]，對皮膚、眼睛和呼吸道等有著強烈的刺激作用[4]。據《2014年中國青少年煙草調查報告》顯示，45.0%的初中學生聽說過電子煙，1.2%的初中學生在過去30 d內使用過電子煙，且青年中使用電子煙的人數比例越來越大[5]。然而現階段關于電子煙安全性評價的證據主要以觀察性研究為主，尚缺乏足夠的實驗證據來說明電子煙對于人體的危害大小。5-羥色胺（5-HT）和苯腎上腺素（PE）是兩種強血管收縮劑。5-HT通過幾種不同類型的受體作用于胃腸道、外周血管和大腦調節系統[6]，同時還是一種強平滑肌收縮刺激劑。PE又稱去氧腎上腺素，激動α受體時有明顯的血管收縮作用，增加外周血管阻力，升高收縮壓和舒張壓。本實驗擬觀察電子煙氣溶膠及其氣溶膠中的化學物質短期急性暴露對去內皮SD大鼠離體SMA收縮反應的影響，初步探究其對于血管平滑肌上5-HT受體和PE受體的影響，以期為電子煙的安全性評價提供參考。

1材料與方法

1.1電子煙氣溶膠提取物（ECAEs）制備 ?在①～③號U型玻璃多孔吸收管中分別加入2、2、1 ml 二甲基亞砜（DMSO），儲液倉刻度線以上加入500 μl煙油。打開大氣采集器（④），調整流速為0.6 L/min，穩定2 min后抽吸電子煙（⑤）3.5 s，間歇30 s的頻率重復抽吸[8]，直至500 μl電子煙消耗至刻度線停止，將U型玻璃多孔吸收管中的吸收液倒出定容至5 ml，-20℃保存，見圖 1。

1.2試劑 ?DMSO購自MP Biomedicals，France。DMEM低糖培養基、雙抗（Penicillin-Streptomycin Solution）均購自Life Sciences， USA。N-亞硝基降煙堿（NNN）購自Augsburg， Germany。4-（甲基亞硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、曲拉通（Triton X-100）、5-HT、PE和乙酰膽堿（Ach）均購自Fluka/Sigma-Aldrich，USA。1，2-丙二醇（HPLC，99.5%）、甘油（HPLC，99.5%）和丙烯醛（GCS，≥99.5%）均購自北京北方偉業計量技術研究院商城分院。原萃煙油（12 mg/ml nicotine）購自Sky Throne Ltd，United Kingdom。PSS（NaCl 119 mmol/L， KCl 4.6 mmol/L， NaHCO3 15 mmol/L， NaH2PO4 1.2 mmol/L， MgCl2 1.2 mmol/L， CaCl2 1.5 mmol/L and glucose 5.5 mmol/L） ，KPSS為 ?60 mmol/L KCl等量替換PSS溶液中的NaCl。

1.3分組與處理 ?雄性SD大鼠（300～350 g）購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號SCXK（川）2015-030。大鼠在SPF級實驗動物中心喂養，自由飲水，飼以普通動物飼料。本實驗研究經西安醫學院倫理委員會批準。實驗分組為DMEM和DMSO對照組，以及ECAEs組、VG組和PG組、NNN組和NNK組、Acr組為實驗組。每組至少使用4只SD大鼠，每只SD大鼠的SMA都剪成8個環段，每兩個環段接受相同藥物和濃度的處理，直至每組的SMA有效環段數n≥6即可統計。

1.4組織準備與培養 ?適應性喂養3 d后開始試驗，大鼠使用CO2安樂死后在解剖顯微鏡下迅速取出SMA置于預冷PSS緩沖液中，使用0.1% Triton X-100灌注血管10 s，再用PSS緩沖液灌注血管2次，以去除內皮細胞。將血管剪成2～3 mm長短的環段置于37℃，5%CO2，95%空氣的濕潤條件，加入青霉素（100 U/ml），鏈霉素（100 mg/ml），再分別加入不同濃度的DMSO、ECAEs、VG、PG、NNN、NNK、Acr于低糖DMEM培養基中培養24 h。

1.5功能試驗 ?將培養后的血管環段固定在微血管張力檢測儀（Organ Bath Model700MO，J.P. Trading， Aarhus，Denmark）的L型針上，在浴槽中加入5 ml預熱至37℃的PSS緩沖液，并持續通入O2以維持pH為7.4，每20 min更換1次PSS。使用LabChart 7 Pro software（AD Instruments，Hastings，UK）連續記錄血管張力變化值。逐步調節SMA靜息張力為2 mN，維持至少2 h使血管達到穩定。隨后使用富鉀（60 mmol/L K+）生理鹽緩沖液KPSS誘導血管收縮，重復2次求平均值作為血管收縮參考值。使用10-5 mol/L Ach檢測內皮完整性，血管無舒張或舒張程度<30%且當血管張力增長>1 mN則可以使用該血管環段。采用濃度累積的方式將5-HT和PE按照10-10、10-9.5、10-9......10-4 mol/L的濃度梯度分別加入不同浴槽中，記錄兩種收縮劑誘導的收縮反應及SMA環收縮效應達到50%的時候所對應的收縮劑的濃度值（pD2值）。

1.6統計學方法 ?采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，數據以（x±s）表示，兩組比較采用Graphpad prism 6雙側Student-t檢驗，多組間比較采用單因素LSD方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示統計學意義顯著。

2結果

2.1電子煙代謝產物及溶劑對5-HT、PE誘導的去內皮SMA收縮量效曲線的影響

2.1.1 DMSO及ECAEs對去內皮SMA收縮反應的影響 ?不同濃度DMSO（1 μl/ml和5 μl/ml） 孵育SMA環24 h后不影響5-HT與PE誘導SMA環的收縮反應，見圖2A。不同濃度的ECAEs 0.2 μl/L和0.4 μl/L孵育SMA環24 h后也不影響5-HT與PE誘導SMA環的收縮反應，見圖2B。

2.1.2 NNN和NNK對去內皮SMA收縮反應的影響 ? NNN 100 μmol/L和NNK 100 μmol/L濃度可使5-HT誘導的收縮曲線在5-HT 累積到10-5 mol/L時開始左移，見圖2Ca、圖2Cc。使用NNN 100 μmol/L濃度孵育SMA環可濃度依賴性增強PE誘導的收縮反應，使量效曲線左移，在PE（10-9～10-7.5mol/L和10-5～10-4mol/L）濃度區間與對照組比較，統計學意義顯著（P<0.01），見圖2Cb。NNK 100 μmol/l濃度孵育SMA環24 h后使PE誘導的收縮曲線顯著左移，在PE（10-5.5～10-4mol/L）濃度區間與對照組比較，統計學意義顯著（P<0.01），見圖2Cd。

2.1.3 PG和VG對去內皮SMA收縮反應的影響 ?不同濃度的丙二醇PG（62.5 μg/ml和250 μg/ml）和甘油VG（0.02 g/ml和0.04 g/ml）孵育SMA環24 h，在5-HT誘導的收縮下可使量效曲線左移，但與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見圖2Da、圖2Dc。PG 62.5 μg/ml孵育SMA環24 h后在PE ? （10-9～10-7mol/L）濃度區間和PG 250 μg/ml孵育SMA環24 h后在PE（10-8.5～10-7.5mol/L）濃度區間與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），量效曲線右移，見圖2D b。由VG孵育后不影響經PE誘導的SMA環的收縮反應 ，見圖2D d。

2.1.4丙烯醛對去內皮SMA收縮反應的影響 ?不同濃度的丙烯醛Acr（50 μmol/L和100 μmol/L）孵育SMA環24 h后均濃度依賴性的增強由5-HT和PE誘導的收縮反應，量效曲線均顯著左移（P<0.01）。且Acr（50 μmol/L和100 μmol/L）均在PE（10-5.5～ ? ? 10-4 mol/L）濃度區間與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2E。

2.2電子煙代謝產物及溶劑對5-HT、PE誘導去內皮SMA收縮反應Emax值和pD2值的影響

2.2.1 DMSO及ECAEs對SMA收縮反應Emax值和pD2值的影響 ?不同濃度的DMSO和ECAEs對5-HT、PE誘導去內皮SMA收縮反應的Emax值和pD2值均無影響，差異無統計學意義（P>0.05），且在DMSO 1 μl/ml和5 μl/ml濃度由K+誘導的收縮反應與空白DMEM組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1、表2。

2.2.2 NNN和NNK對SMA收縮反應Emax值和pD2值的影響 ?NNN 100 μmol/L和NNK 100 μmol/L濃度孵育SMA環24 h，可使5-HT誘導的收縮曲線Emax值與對照組DMSO 1 μl/ml比較，差異有統計學意義（P<0.05）。NNN 100 μmol/L孵育SMA環24 h還可使pD2值增大，與DMSO 1 μl/ml組比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。NNN 100 μmol/L和NNK 100 μmol/L濃度孵育SMA環24 h也可使PE誘導的收縮曲線Emax值與對照組DMSO 1 μl/ml比較，統計學意義顯著（P<0.01），但不影響pD2值，見表2。

2.2.3 PG和VG對SMA收縮反應Emax值和pD2值的影響 ?不同濃度PG和VG對5-HT、PE誘導去內皮SMA收縮反應的Emax值均無影響，差異無統計學意義（P>0.05），見表1、表2。但PG 250 μg/ml和VG 0.02 g/ml濃度可增強5-HT誘導收縮的pD2值，與DMEM組比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2.4 Acr對SMA收縮反應Emax值和pD2值的影響 ?Acr 50 μmol/L和100 μmol/L濃度孵育SMA環24 h可使5-HT和PE誘導的收縮曲線Emax值均與對照組DMSO 1 μl/ml比較，統計學意義顯著（P<0.01），但對pD2值沒有影響，見表1、表2。

3討論

電子煙氣溶膠的主要成分有甘油和丙二醇，這種吸濕高滲性的氣溶膠可沉積在肺部深處，減緩人支氣管上皮細胞的代謝[8]，降低原代人支氣管上皮細胞的細胞活力[9]，提高促炎標志物（MCP-1，IL-6，IL-8）的水平[10]，這些炎癥因子可誘導氣道上皮的損傷。氣溶膠中的煙堿與環境中的亞硝酸（HONO）反應形成致癌的煙草特有的亞硝胺（TSNAs）類物質NNN和NNK，其中尼古丁的轉化率高達0.4%，屬于IARC 1類致癌物[2，11，12]。而丙烯醛（IARC 3類致癌物）則是甘油（VG）和丙二醇（PG）在高溫加熱時產生的熱脫水產物。作為一種刺激性的強氧化劑[13]，可直接作用于肺部，增強氧化應激，引起機體大分子的損傷（DNA，脂質和蛋白質）[4]。丙烯醛的慢性吸入抑制內皮祖細胞的循環促進了動脈粥樣硬化，使主動脈硬化速度加快1.6倍;另據研究報道當電子煙的電壓由3.3 V變為4.4 V時，醛類物質產生3倍以上，丙烯醛排放量增加10倍;電子煙通過高電壓電池作用排放醛類化合物的含量甚至可能超過傳統卷煙產生的排放量[13，14]。

本研究結果顯示，NNN和NNK提高了5-HT誘導收縮曲線的Emax值，pD2值也提示NNN對于5-HT受體的親和力的增強。NNN和NNK還使PE誘導的SMA環收縮曲線均顯著左移且增強了收縮反應的Emax值。氣溶膠中的丙烯醛使5-HT和PE誘導的收縮曲線顯著左移和收縮反應Emax值顯著增強，該現象可能由5-HT受體或α受體數量增多 ?或與相應受體結合能力增強所致。煙油主要成分 ? 甘油和丙二醇使5-HT誘導的收縮曲線與DMSO ? 1 μl/ml組無明顯差異，但是二者可使5-HT誘導收縮反應的pD2值均顯著增強。而ECAEs卻沒有對腸系膜上動脈產生影響，其原因可能由于氣溶膠中與煙草煙霧相比，其有毒成分的含量通常低得多，并且短期暴露對于腸系膜上動脈也可能不會產生影響。NNN和NNK等混合著丙烯醛、甘油和丙二醇等有毒化合物形成的電子煙氣溶膠，長期作用會對心血管系統造成不良的影響，成為心血管疾病發生的危險因子。本研究通過動物體外實驗證實電子煙氣溶膠中的一些成分確實會對去內皮的大鼠腸系膜上動脈平滑肌的收縮功能有所影響，然而短期體外實驗不能充分解釋電子煙氣溶膠中成分引起血管收縮增強的原因，后期將通過長期染毒實驗對電子煙的安全性評價提供更充分地證據。

綜上所述，電子煙氣溶膠中的一些成分增強去內皮大鼠腸系膜上動脈的收縮功能，增強了5-HT受體和α受體與電子煙氣溶膠成分的結合力和效應表達，本研究為電子煙安全性評價提供了新的證據。

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收稿日期：2019-11-28;修回日期：2020-01-17

編輯/肖婷婷