CT23基因在腦腫瘤中的表達情況及臨床價值

鄭葆龍 肖紹文

摘要：目的 ?檢測和明確癌-睪丸相關抗原（CTA）CT23基因在人腦腫瘤中的表達情況，評估該基因潛在的臨床價值。方法 ?收集廣西醫科大學第一附屬醫院神經外科14例顱腦腫瘤病理標本，包括星形細胞瘤5例，髓母細胞瘤4例，膠質母細胞瘤5例，使用RT-PCR技術檢測CT23基因在不同病理類型的腦腫瘤中的表達情況，比較其在不同類型腦腫瘤中的表達差異。結果 ?14例腦腫瘤樣本中13例CT23表達陽性，其中星形細胞瘤4例，膠質母細胞瘤5例，髓母細胞瘤4例，CT23基因在三類腦腫瘤樣本中的表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論 ?CT23基因作為一種腫瘤相關的基因，可表達于多種類型的人類腦腫瘤中，另外該基因的表達與腦腫瘤的發生、發展可能有關。

關鍵詞：CT23基因;腦腫瘤;癌-睪丸抗原;逆轉錄聚合酶鏈反應

中圖分類號：R739.4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.028

文章編號：1006-1959（2020）05-0094-03

Abstract：Objective ?To detect and clarify the expression of the cancer-testis-associated antigen （CTA） CT23 gene in human brain tumors， and to evaluate its potential clinical value. Methods ?Collected 14 cases of craniocerebral tumor pathological specimens from Neurosurgery Department of the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， including 5 cases of astrocytoma， 4 cases of medulloblastoma， and 5 cases of glioblastoma. RT-PCR was used to detect the expression of CT23 gene in brain tumors of different pathological types， and to compare the expression difference of CT23 gene in different types of brain tumors.Results ?The CT23 gene expression was positive in 13 of 14 brain tumor samples， including 4 astrocytomas， 5 glioblastomas， and 4 medullary tumors. Comparison of CT23 gene expression in three types of brain tumor samples， the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion ?As a tumor-related gene， CT23 gene can be expressed in many types of human brain tumors. In addition， the expression of this gene may be related to the occurrence and development of brain tumors.

Key words：CT23 gene;Brain tumor;Cancer-testis antigen;Reverse transcription polymerase chain reaction

腦腫瘤（brain tumor）具有治療難度大，致死率高的特點，我國腦腫瘤發病率呈現出逐年增加的趨勢，嚴重影響了人民的健康。腦膠質瘤是最常見的成人惡性腦腫瘤，約占顱內腫瘤的17%[1]，發病率約為3/10萬[2]，具有惡性腫瘤的典型生物學特性，呈浸潤性生長，腫瘤與周圍正常腦組織邊界不清[3]。有研究利用基因表達系統分析（SAGE）方法從人類睪丸cDNA文庫中發現了CT23基因，該基因位于人類第12號染色體短臂1區2帶到1區3帶之間（12p12～13），全長1933 bp，共10個外顯子，可以編碼543個氨基酸，特異性地定位于幾種物種的生殖細胞的頂體中，包括小鼠、豬、豚鼠和人[4]。CT23基因表達的相關抗原，在睪丸生精小管和人類眾多腫瘤組織中廣泛存在，如乳腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、骨髓瘤、前列腺癌、肝癌等[5-9]。研究表明[10]該抗原在精子中參與了獲能和頂體反應，而在其他正常組織中卻幾乎不表達，根據該基因的這一特性，本研究認為其有望成為用于判斷腫瘤類型和腫瘤免疫治療的理想靶分子[11]。因此，本實驗通過探究CT23基因在多種類型的腦腫瘤中的表達，旨在為未來該基因的研究奠定理論和實驗基礎。

1材料與方法

1.1樣本來源 ?收集廣西醫科大學第一附屬醫院神經外科腦腫瘤樣本14例，包括星形細胞瘤5例，髓母細胞瘤4例，膠質母細胞瘤5例。所有樣本均經過病理學檢查，已通過廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審查和授權，相關操作符合世界醫學協會赫爾辛基宣言關于人體醫學研究的倫理準則。所有新鮮腫瘤組織取自腫瘤切除后10 min內立即用凍存管進行分裝和標記，然后放入液氮罐速凍，及時用液氮保溫瓶帶回實驗室，放置于-80℃冰箱保存備用。

1.2設備及耗材 ?超低溫冰箱（青島海爾）超微量分光光度計（北京天根公司）電子天平PB602-N（上海精密科學儀器有限公司）低壓電泳儀（Bio-Rad公司）微量移液器（德國Eppendorf公司）普通PCR儀（德國Eppendorf公司）紫外線凝膠電泳成像分析系統（天能UV2000）電泳槽DYCP-31BM（六一儀器廠）臺式冷凍離心機（德國Eppendrof公司）離心管及PCR管（Axygen公司）。引物組織總RNA 提取試劑盒（Sangon公司），逆轉錄試劑盒，PCR反應試劑盒（南京諾唯贊公司），溴化乙錠（Sigma公司）。

1.3除RNA酶 ?提取總RNA及逆轉錄過程中，除已標明為Rnase-free的實驗用品之外，其他塑料制品（如：EP管、離心管、移液器槍頭等）均需要進行除RNA酶處理后方可使用。佩戴一次性口罩，一次性乳膠手套或PE手套，嚴格按照具體操作規范進行，防止RNA酶污染導致的RNA提取失敗。

1.4提取總RNA ?取冰凍腫瘤組織（-80℃），天平秤取50 mg置于10 ml離心管中，再加入500 μl Buffer RL1（已加入β-巰基乙醇），離心管外加冰盒，用高速電動勻漿器間斷高速勻漿1～2 min，將組織徹底研磨均勻，勻漿后震蕩2 min，室溫靜置備用。根據組織總RNA提取試劑盒（諾唯贊公司）說明書的有關步驟繼續進行相應的提取工作。提取完成的總RNA樣品，均進過超微量分光光度計的檢測和瓊脂糖凝膠電泳的檢測，對符合要求的總RNA樣品直接進行逆轉錄反應。

1.5 cDNA合成 ?CT23基因的特異性引物序列為：5-AAGGACAGGGGACTAAGGAG-3（上游引物），5-CCGTACAAATCCAGCCCGTA-3（下游引物）[12]。取2 μg總RNA，依據逆轉錄試劑盒的相關步驟進行RNA的逆轉錄，cDNA的質量用人類管家基因GAPDH進行檢測和判斷，GAPDH基因的引物序列和相關的PCR反應條件均來源于文獻[13]。

1.6 RT-PCR反應 ?采用能夠特異性擴增CT23基因的引物進行PCR反應，反應條件如下：預變性（94℃、5 min）、變性（94℃、1 min）、退火（59℃、1 min）、延伸（72℃、2 min）、循環數（35）、徹底延伸（72℃、8 min）。所有相關的擴增反應均采用已經過確認的陽性細胞株樣本作為陽性對照，用雙蒸水代替組織樣本的cDNA作為陰性對照，反應結束后立即進行濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳100 V、30 min，然后進行凝膠成像并記錄相應結果。

1.7統計學分析 ?實驗數據采用SPSS 20.0軟件統計分析，計數資料采用（n，%）表示，采用確切概率法或四格表？字2檢驗;當P<0.05時表示差異有統計學意義。

2結果

CT23的表達情況：CT23相應引物可特異性擴增出大小約600 bp的基因片段，根據相關文獻報道，該片段來源于CT23基因，14例腦腫瘤樣本中CT23陽性表達13例，基因陽性率約為92.86%（13/14），其中星形細胞瘤80.00%（4/5），膠質母細胞瘤100.00%（5/5），髓母細胞瘤100.00%（4/4），CT23基因在三類腦腫瘤樣本中的表達比較，差異無統計學意義（P>0.05）。CT23基因表達凝膠成像見圖1。

3討論

近年來，腫瘤-睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）家族受到越來越多的科研工作者的關注，CT23作為該家族的一員，也已經開展了一系列的研究。目前有關該基因的研究主要集中于以下幾個方面：①基因表達及表達機制的研究：多個研究報道CT23基因在多種腫瘤中表達，本實驗結果也證實了CT23可在多種腦腫瘤中表達。②功能方面的研究：通過siRNA 在體外干擾CT23基因的表達，可明顯地減低降低細胞周期調控蛋白cyclin E，遷移/侵襲調節蛋白MMP2和MMP9的表達，有研究發現在體外下調CT23基因的表達可導致膠質瘤細胞和肝癌細胞的惡性生物學行為減弱[14，15]以及骨髓間充質干細胞的生長周期停滯和遷移能力的減弱[16]，也可通過促進有絲分裂過程中的紡錘絲的形成，來增加腫瘤細胞的遷移能力[4]。③CT23與免疫調節機制的關系：該基因在結直腸癌患者體內的表達可以引起患者的體液免疫應答[17]，其中CT23抗原肽的表達可被CD8特異性識別[18]。

現在已知的抗體類標記物大多來源于腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA），腫瘤組織表達的特異性蛋白能誘導機體產生非特異性免疫反應和特異性免疫反應，如細胞免疫反應和體液免疫反應[19]。已經開展的有關癌-睪丸抗原的疫苗研究顯示出對患者預后的積極作用，因此CTA有望成為未來治療惡性腦腫瘤的潛在靶抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），尤其是在一些腫瘤患者的體液或血液中已經檢測到腫瘤相關抗體[20，21]，說明其在腫瘤早期診斷過程具有重要的輔助作用，具有很大研究潛力。

根據2016年世界衛生組織公布的2007中樞神經系統腫瘤分類第四版修訂版的最新分類標準，膠質瘤的來源是神經祖細胞，其中有IDH基因突變的為有IDH突變的神經膠質瘤;沒有IDH基因突變的膠質瘤為IDH野生型星形細胞瘤。而髓母細胞瘤不屬于膠質瘤，已被劃分到胚胎性腫瘤，這進一步加強了有關原癌基因激活和相關致癌作用的機理研究。在臨床工作中，通過對癌基因的激活與變異的檢測，確定腫瘤的相關病理分類，明確能夠直接導致腫瘤細胞凋亡或者直接引起腫瘤事件發生的相關基因是腫瘤分類的基礎和前提。自Ono T 等[12]報道了人類 CT23基因以來，國內外對CT23與腫瘤間的聯系進行了較多的研究，如卵巢癌、大腸癌、乳腺癌、肝癌等，并預測 CT23基因在腫瘤組織中的表達可能與臨床資料存在相關性。本實驗通過檢測CT23基因在人類腦腫瘤中的表達情況，發現其具有較高的表達頻率，說明該基因具有成為靶向治療的靶點的潛力。

總之，本研究證實了CT23基因可表達于多種類型的人類腦腫瘤中，在未來的研究工作中，擬通過增加樣本量，在現有研究結果的基礎上，獲得更加準確的結論。同時，通過擴大研究方法，如高通量測序技術、免疫組化及基因敲除等相關技術手段，對CT23基因進行更深入的研究。

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收稿日期：2019-12-09;修回日期：2019-12-19

編輯/成森