實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)診斷結(jié)核病的價(jià)值

張國(guó)福

摘要：目的 ?分析實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 ?選取2018年3月～2019年3月在我院診治的76例結(jié)核病患者為研究對(duì)象，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，各38例。對(duì)照組采用涂片抗酸染色法，觀察組采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，比較兩組檢測(cè)陽(yáng)性率、隱性率、靈敏度、特異度。結(jié)果 ?觀察組陽(yáng)性率為78.94%，高于對(duì)照組的23.68%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組靈敏度為97.36%、特異度為71.05%，均高于對(duì)照組的76.08%、65.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?在結(jié)核病診斷中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，檢出陽(yáng)性率高，且診斷靈敏度、特異度高，在結(jié)核病診斷中具有一定參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè);結(jié)核病;診斷價(jià)值

中圖分類(lèi)號(hào)：R521 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.057

文章編號(hào)：1006-1959（2020）05-0159-02

Abstract：Objective ?To analyze the application value of real-time fluorescent quantitative detection in the diagnosis of tuberculosis.Methods ?A total of 76 patients with tuberculosis diagnosed and treated in our hospital from March 2018 to March 2019 were selected as the research subjects. They were divided into control group and observation group by random number table method， with 38 cases in each group. The control group was smeared with acid-fast staining， and the observation group was tested with real-time fluorescent quantitative detection. The positive rate， recessive rate， sensitivity， and specificity of the two groups were compared.Results ?The positive rate in the observation group was 78.94%， which was higher than 23.68% in the control group，the difference was statistically significant（P<0.05）. The sensitivity of the observation group was 97.36% and the specificity was 71.05%， which were higher than the 76.08% and 65.21% in the control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion ?The application of real-time fluorescent quantitative detection in the diagnosis of tuberculosis has a high positive detection rate， high diagnostic sensitivity and specificity， and has certain reference value in the diagnosis of tuberculosis.

Key words：Real-time quantitative fluorescence detection;Tuberculosis;Diagnostic value

結(jié)核病（tuberculosis）是一類(lèi)嚴(yán)重的傳染性疾病，我國(guó)約有2000萬(wàn)人次活動(dòng)性肺結(jié)核患者，由于結(jié)核病治療周期長(zhǎng)，并且會(huì)出現(xiàn)耐藥性結(jié)核菌，進(jìn)一步增加了結(jié)核病控制和抗結(jié)核治療的難度[1]。臨床常規(guī)痰液涂片抗酸染色法，容易受到結(jié)核病病原菌陽(yáng)性檢出率低的影響，早期結(jié)核病診斷率低。目前臨床檢測(cè)結(jié)核病病原菌的方式比較多，對(duì)于不同的診斷方式來(lái)說(shuō)檢測(cè)結(jié)果也不相同。實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)方法是近年新興的基因診斷技術(shù)，是在反應(yīng)體系當(dāng)中加入了1 個(gè)熒光標(biāo)記探針，繼而在檢驗(yàn)的過(guò)程當(dāng)中， 充分借助Taq 酶外切核酸酶活性促進(jìn)熒光信號(hào)的釋放， 于擴(kuò)增的這一過(guò)程當(dāng)中， 每當(dāng)模板復(fù)制1 次， 便可以釋放出1 個(gè)熒光信號(hào)，而基于對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)弱度的判斷， 便可精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)對(duì)模板的定量。本研究結(jié)合2018年3月～2019年3月在我院診治的76例結(jié)核病患者臨床資料，分析實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)對(duì)結(jié)核病患者的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 ?選取2018年3月～2019年3月在佳木斯市傳染病院診治的76例結(jié)核病患者為研究對(duì)象，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，各38例。排除合并有嚴(yán)重的心、臟等重要器官疾病者。對(duì)照組男性21例，女性17例;年齡25～63歲，平均年齡（39.45±8.30）歲;病程1～8個(gè)月，平均病程（2.89±1.05）個(gè)月。觀察組男性23例，女性15例;年齡24～61歲，平均年齡（38.76±9.05）歲;病程1～7個(gè)月，平均病程（2.55±0.96）個(gè)月。兩組年齡、性別、病程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加本研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1對(duì)照組 ?采用涂片抗酸染色法，具體方法：獲取痰液標(biāo)本，在痰膜上蓋滿石炭酸復(fù)紅染液，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，染色5 min 后洗去染色液，瀝干剩余的水加5% 的鹽酸酒精脫色至無(wú)色，瀝干后加亞甲藍(lán)復(fù)染30 s，沖去復(fù)染液，自然干燥后鏡檢。參照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃-痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作質(zhì)量保證手冊(cè)》給出光學(xué)顯微鏡檢查報(bào)告。

1.2.2觀察組 ?采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，具體方法：首先提取DNA：采集患者痰液標(biāo)本，將其置入試管，加入1 ml的4%氫氧化鈉溶液（上海生物科技有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20130211，規(guī)格：5.0 g∶500 ml），均勻搖混，常溫靜置20 min，標(biāo)本液化后采集1 ml標(biāo)本液化的混合液，進(jìn)行離心處理5 min（2600 r/min）后，將上清液去除，取出離心管沉淀物，加入1 ml的0.9%氯化鈉注射液（東齊都藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20113297，規(guī)格：4.5 g∶500 ml），再次離心5 min，并取出沉淀物，最后將50 μl的DNA提取液加入其中，均勻搖混后，置于-20℃的條件下保存待檢。將上清液提取2 μl，加到PCR反應(yīng)管中，離心1 min，放入儀器（過(guò)ABI 7500熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）樣品槽中。分別在93 ℃ 2 min、55 ℃ 45 s，65 ℃ 60 s進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，93 ℃下30 s、55 ℃下45 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將陰性質(zhì)控品作為陽(yáng)性定量參考數(shù)據(jù)。采用FQ-PCR軟件閾值，獲得呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的擴(kuò)增曲線。當(dāng)擴(kuò)增曲線Ct值≤36時(shí)，確定為陽(yáng)性病例，>40確定為陰性病例，如果Ct值介于37～40，進(jìn)行再次測(cè)定，并以再次測(cè)定獲得的結(jié)果作為評(píng)判依據(jù)，如果再次檢驗(yàn)Ct值仍介于37～40，則判定為陰性。

1.3觀察指標(biāo) ?比較兩組檢測(cè)陽(yáng)性率、陰性率、靈敏度、特異度。靈敏度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100%、特異度=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）×100%[2]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料采用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，兩組間比較采用？字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組結(jié)核病陽(yáng)性率、陰性率比較 ?觀察組陽(yáng)性率高于對(duì)照組，陰性率低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2兩組檢測(cè)靈敏度、特異度比較 ?觀察組靈敏度、特異度均高于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表2。

3討論

結(jié)核病屬于傳染性疾病，主要是因結(jié)核分枝桿菌感染所引發(fā)的一種疾病，感染發(fā)生之后，病菌會(huì)侵入人體全身的各個(gè)器官當(dāng)中。結(jié)核病多發(fā)肺部，在皮膚、腦膜等均可發(fā)病，肺結(jié)核主要通過(guò)呼吸道感染傳染，飛沫感染最為常見(jiàn)。疑似患者就診，多結(jié)合既往病史、影像學(xué)檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行診斷[4]。實(shí)驗(yàn)室檢查方法常見(jiàn)的有痰涂片抗酸染色法、痰培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)等，其中痰涂片抗酸染色法通過(guò)鏡檢可直接觀察到分枝桿菌，但是容易受到痰液標(biāo)本質(zhì)量、檢驗(yàn)人員主管因素等影響，降低陽(yáng)性檢出率[4]，同時(shí)主觀判斷結(jié)果缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，易漏診。此外，有100 多種的分枝桿菌同樣是呈抗酸染色陽(yáng)性的;其次便是抗酸桿菌的形態(tài)和大小變化均較大， 會(huì)使得結(jié)果判斷出現(xiàn)差異。同時(shí)因?yàn)槭艿骄w分布不均的影響，判讀結(jié)果會(huì)存在差異，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法是一種基因診斷技術(shù)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用與各種病原體核算檢測(cè)當(dāng)中。該方法操作便捷，整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程在3 h內(nèi)便可完成，在很大程度上縮短了實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間，在一定程度上提高了檢驗(yàn)效率。實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)是在反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上將熒光標(biāo)記探針融入其中，在檢驗(yàn)的過(guò)程中根據(jù)外切核酸酶活性將熒光信號(hào)釋放出來(lái)，根據(jù)釋放出來(lái)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱度可對(duì)模板進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)。涂片抗酸染色法與痰培養(yǎng)是臨床診斷肺結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而涂片抗酸染色法極易受到痰液標(biāo)本質(zhì)量與檢驗(yàn)人員的影響，因此檢出率比較低。

本研究結(jié)果顯示，觀察組陽(yáng)性率為78.94%，高于對(duì)照組的23.68%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)陽(yáng)性檢出率相對(duì)比較高，該結(jié)論與張愛(ài)梅[5]報(bào)道基本一致。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)均采用1次行耗材，專(zhuān)區(qū)操作，有利于控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)標(biāo)本的污染因素，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確率。此外，觀察組靈敏度為97.36%、特異度為71.05%，均高于對(duì)照組的76.08%、65.21%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)診斷結(jié)核病，靈敏度、特異度均較高，進(jìn)一步促進(jìn)了臨床檢驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)度。

綜述所述，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)陽(yáng)性檢出率高，且靈敏度、特異度良好，對(duì)臨床結(jié)核病患者診治具有良好的指導(dǎo)作用。同時(shí)采用的擴(kuò)增技術(shù)對(duì)于含有結(jié)核菌量比較低的樣本有著極高的應(yīng)用價(jià)值，提高檢驗(yàn)的精準(zhǔn)程度。

參考文獻(xiàn)：

[1]張治國(guó)，歐喜超，孫倩，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究[J].中國(guó)防癆雜志，2014，35（1）：13-16.

[2]李輝，譚耀駒，李洪敏，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的診斷效果對(duì)比研究[J].中國(guó)防癆雜志，2014，36（6）：472-476.

[3]李光友，蘇貴靈，高杰，等.不同臨床標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷結(jié)核分枝桿菌的檢出率差異研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，28（1）：90-92.

[4]曹燕珍，胡佳捷，王翠翠，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在結(jié)核病中的診斷價(jià)值[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2015，28（23）：3178-3179.

[5]張愛(ài)梅，李鋒，劉旭暉，等.結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)在肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值[J].中華傳染病雜志，2016，34（3）：174-179.

收稿日期：2019-11-28;修回日期：2019-12-10

編輯/馮清亮