膠原蛋白海綿復合種子細胞對兔尺骨缺損的修復效果

楊森，馮付明

(鄭州市第七人民醫院 骨科，河南 鄭州 450000)

骨缺損骨不愈合臨床較常見，也是目前骨科的研究熱點。本實驗選用體外培養的新西蘭大白兔骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和成骨細胞(osteoblast，OB)作為組織工程骨的種子細胞，膠原蛋白海綿作為種子細胞的支架材料，細胞和載體體外培養1周，移植入新西蘭大白兔尺骨中段1.5 cm節段性骨缺損處，觀察兔BMSCs和OB體外培養情況，細胞與載體的相容性及體外構建的組織工程骨修復新西蘭大白兔尺骨骨缺損的情況，為骨缺損組織工程技術治療中種子細胞的來源及載體的選擇尋求一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗主要試劑、設備

1.1.1 實驗動物 出生14日齡乳兔1只；孕28～30 d新西蘭兔1只；參照Delgado-ruiz等[1]文獻，采用健康6月齡新西蘭成年大白兔27只，雌雄各半，清潔級，體質量為2.2～2.8 kg，平均2.5 kg。以上動物均由新鄉華蘭生物疫苗公司提供，動物合格證號：SCXK(豫)2010-0001。

1.1.2 主要試劑及設備 DMEM-LG 、DMEM-HG (Hyclone 公司，美國)，胰酶、青鏈霉素溶液(genview公司，美國)，胎牛血清(FBS Gibico公司 ，美國)，β-甘油磷酸鈉粉劑、地塞米松(Sigma，美國)，茜素紅染液(北京索萊寶科技有限公司)，抗壞血酸(南京第三制藥廠)，Percoll分離液(Pharmacia，美國)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物制品有限公司)，醫用膠原蛋白海綿(無錫貝迪生物工程有限公司)，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，CO2孵箱(Thermo，美國)，高速低溫離心機(Hitachi，日本日立公司)，恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)。

1.2 種子細胞的提取及傳代培養

1.2.1 BMSCs的分離及培養 取14日齡乳兔1只，耳緣靜脈注射空氣處死，無菌條件下完整切取四肢長骨，移入超凈臺內，用肝素預濕的20 mL注射器吸取無血清的DMEM-LG 培養基沖洗出骨髓，收集含骨髓的懸液裝入無菌離心管，以1 000 r·min-1速度離心5 min，棄上清和脂肪，將剩余懸液沿離心管壁緩慢滴入底部含等體積量的Percoll分離液(密度為1.073 g·mL-1)的離心管中[2]，以3 000 r·min-1速度離心30 min。離心后液體分為3層，巴氏吸管吸取中間交界處云霧狀的單核細胞層裝入離心管，加入少量無血清DMEM-LG培養基漂洗，以1 000 r·min-1速度離心5 min，棄上清，重復漂洗1次。將沉淀加入BMSCs生長培養液[含DMEM-LG培養基、體積分數為10%的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素]，制成單細胞懸液后進行細胞計數，調整細胞密度至1×106mL-1，接種于25 cm2培養瓶，置于37 ℃含體積分數為5% CO2的恒溫恒濕培養箱。48 h首次半量換液，72 h全量換液，以后每3 d換液1次。待BMSCs長滿瓶底90%時，按1∶2比例傳代培養，細胞傳至第3代時備用。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。

1.2.2 改良酶消化法提取兔OB 100 g·L-1水合氯醛腹腔麻醉孕兔，無菌條件下剖腹取產前1周的胎兔，超凈臺內取出胎兔顱蓋骨，放入含青霉素、鏈霉素的0.01 mol·L-1PBS液的培養皿內清除骨膜、血管及結締組織[3]，無菌PBS液沖洗顱蓋骨1次。然后將顱蓋骨剪成1 mm3的骨片，加入盛有5 mL質量濃度為2.5 g·L-1胰酶的離心管中，37 ℃水浴15 min，棄上清液。將骨片移入含等量1 g·L-1Ⅰ型膠原酶和2.5 g·L-1胰酶各5 mL的離心管，37 ℃恒溫振蕩20 min，200目濾網過濾，保留濾網上骨殘渣，將含有細胞的濾過液加入胎牛血清終止消化，然后放入冰塊中冰浴。將骨殘渣按上述方法重復操作1次，留取濾過液和含細胞的第1次濾過液混合，然后將含細胞的濾過液用低溫離心機以1 000 r·min-1速度離心5 min，棄上清液。沉淀加入OB培養液(含DMEM-HG培養基、體積分數為10%的FBS、50 mg·L-1的L-抗壞血酸、10 mmol·L-1的β-甘油磷酸鈉、100 U·mL-1的青霉素、100 mg·L-1的鏈霉素)，吹打混勻并調整細胞密度，按1×106個·mL-1接種于25 cm2培養瓶。放置于37 ℃含體積分數為5% CO2的恒溫恒濕培養箱。48 h后首次全量換液，以后每3 d換液1次，傳代方法同BMSCs。

1.3 種子細胞的鑒定方法

1.3.1 倒置相差顯微鏡觀察 原代培養傳代前照相，對第1代細胞采用尹紅-蘇木素染色，鏡下觀察種子細胞的形態和生長狀況。

1.3.2 Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白免疫組化染色 分別取第3代兔BMSCs和第3代兔OB于預置有蓋玻片的6孔板內進行培養，1周后用0.1 mol·L-1的PBS緩沖液輕洗3遍，按照Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白免疫組織化學染色方法及試劑盒說明，進行免疫組化染色。

1.3.3 鈣結節茜素紅染色 細胞接種方法同上，棄培養基，培養板用PBS沖洗2次，400 g·L-1的多聚甲醛固定30 min，蒸餾水沖洗3次，1 g·L-1茜素紅[茜素紅-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色，37 ℃染色30 min，蒸餾水沖洗。倒置顯微鏡下觀察礦化結節。

1.4 細胞-膠原蛋白海綿支架復合物的制備及檢測

1.4.1 細胞-支架復合物制備 收集第3代OB和BMSCs，用含體積分數為10%的FBS的DMEM-LG培養液制成濃度為1×106個·mL-1的細胞懸液。制備3種細胞-支架復合物，分別為OB-支架復合物(A組)、BMSCs -支架復合物(B組)及混合細胞-支架復合物(C組，OB和BMSCs比例為1∶1)。按照細胞懸液反復滴加的方法，分別將0.1 mL OB、BMSCs、混合細胞懸液均勻分布于膠原蛋白海綿支架上。將細胞-支架復合物置于37 ℃含體積分數為5% CO2的培養箱中孵育3 h，待細胞黏附于支架表面后，加入含體積分數為10%的FBS相應細胞培養液，混合細胞加入OB培養液，每2 d換液1次，培養1周備用。

1.4.2 MTT測定支架內細胞增殖活性 將無菌膠原蛋白海綿裁制成5 mm×5 mm×5 mm大小[4]，分別置于96孔板中，調整OB、BMSCs及混合細胞密度為1×106個·mL-1，將0.1 mL細胞懸液緩慢滴加于支架的表面，37 ℃含體積分數為5% CO2培養箱中培養，分別于第1、2、4、6、8天對3組細胞采用MTT法檢測490 nm處吸光度(A)值，每組設3個復孔，并設空白對照組，繪制3組細胞生長曲線。

1.5 動物分組與造模 取健康6月齡體質量2.5 kg左右新西蘭大白兔27只，做雙側尺骨中段1.5 cm節段性骨缺損模型，按植入的修復物隨機分成3組，每組9只。A組為OB+膠原蛋白海綿；B組為BMSCs+膠原蛋白海綿；C組為混合細胞+膠原蛋白海綿；D組為膠原蛋白海綿，作為自身對照。為了方便觀察，右側作為不同分組側，左側作為自身對照側。造模方法[5-7]：100 g·L-1水合氯醛麻醉動物滿意后，取仰臥位前臂尺側中段切開皮膚，分離皮下組織至骨膜，用骨科微型電鉆將尺骨鷹嘴下2.5～3.0 cm處一段尺骨連同骨膜一并截除，制成長1.5 cm節段性缺損，然后植入相應組織工程骨，術后均予青霉素(40萬U)肌內注射預防感染，分籠飼養。各組分別于術后4、8和12周每個時間點處死3只動物做相關檢查。

1.6 標本檢測及方法

1.6.1 骨標本大體觀察及術后12周兔尺骨缺損愈合后幾何參數測量 各組動物在術后4、8、12周3個時間點分別處死3只，肉眼觀察骨缺損修復情況，測量術后12周兔尺骨缺損區愈合后幾何參數變化。

1.6.2 骨缺損區HE組織染色 分別截取包括兩端各5 mm正常骨質的標本，100 g·L-1中性甲醛固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋，縱行切片，分別行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察成骨情況。

1.6.3 X線檢查 于術后當天及各時間點攝雙側尺橈骨正位片，曝光條件為40 kV、50 mA、0.2 s，投照距離為75 cm，觀察骨痂生長和骨連接情況。以Lane—Sandhu X 射線評分標準評估骨形成及塑形評分，總分12分，以第4周、第8周、第12周各時間點取各組X線得分，取各時間參考點X線平均值作為結果進行統計學分析，骨愈合的Lane—Sandhu X線評分標準見表1。

表1 骨愈合的Lane—Sandhu X線評分標準

2 結果

2.1 種子細胞的鑒定

2.1.1 原代培養細胞 見圖1。

A—BMSCs原代第5天；B—兔OB原代第10天；C—BMSCs HE染色；D—兔OB HE染色。圖1 骨髓間充質干細胞(BMSCs)和成骨細胞(OB)原代培養細胞(×100)

2.1.2 Ⅰ型膠原酶原和Ⅲ型膠原酶原免疫組化染色 見圖2。

A—BMSCs Ⅰ型膠原蛋白染色；B—BMSCs Ⅲ型膠原蛋白染色；C—兔OB Ⅰ型膠原蛋白染色；D—兔OB Ⅲ型膠原蛋白染色。圖2 骨髓間充質干細胞(BMSCs)和成骨細胞(OB)Ⅰ型膠原酶原和Ⅲ型膠原蛋白免疫組化染色結果(×100)

2.1.3 茜素紅染色 見圖3。

A—兔OB；B—BMSCs。
圖3 骨髓間充質干細胞(BMSCs)和成骨細胞(OB)茜素紅染色結果(×100)

2.2 種子細胞與膠原蛋白海綿的相容性

2.2.1 種子細胞在膠原蛋白海綿表面黏附 見圖4。

2.2.2 種子細胞在膠原蛋白海綿支架上的增殖(MTT法) 生長曲線繪制：以培養天數為橫軸，實驗孔減去空白孔的吸光度值為縱軸，繪制1條連續的曲線。BMSCs、OB、混合細胞3組的細胞數量均隨著培養時間的延長而增加，在培養的第8天達到峰值, 通過對第3代3組細胞的計數，繪制出的生長曲線呈S形。見圖5。接種的第0～2天為細胞適應期，細胞增殖不明顯；第3～6天為細胞的對數增長期，細胞在短時間內大量增殖；第7天為平臺期，細胞增殖逐漸變緩。

A—BMSCs；B—兔OB；C—混合細胞。圖4 種子細胞接種至膠原蛋白海綿第3天結果(×100)

圖5 種子細胞在膠原蛋白海綿支架上的增殖情況

2.3 標本測量結果

2.3.1 標本大體觀察和HE染色結果 見表2。

2.3.2 術后12周骨缺損區幾何參數測量結果 4組矢狀徑、冠狀徑、骨痂厚度、骨密度比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。進一步兩兩比較，混合細胞組矢狀徑、冠狀徑、骨痂厚度、骨密度與A組、B組、D組比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表2 標本大體觀察和HE染色結果

2.3.4 各組骨缺損修復X線 4周時，A、B、C 3個實驗組骨缺損處材料密度增高呈云霧狀，均勻分布在骨缺損區；D組僅在缺損兩端有少量的云霧狀骨痂生成，缺損區中央部分無骨生成影像。8周時，A、B、C 3個實驗組材料與宿主骨交界處模糊，形成大小不一的骨痂；D組仍僅在缺損兩端有骨痂生成，缺損區中央部分無明顯骨生成影像。12周時，A、B、C 3個實驗組材料邊緣部分區域密度接近宿主骨，各組形成骨痂大小及密度有差異，C組出現髓腔再通，A組和B組出現部分髓腔再通，骨缺損區域密度大部分接近宿主骨；D組骨缺損處骨不愈合，但骨缺損兩端有少許高密度影。見圖7。4組在4、8和12周的評分值比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。進一步兩兩比較，混合細胞組4、8和12周的評分值與A組、B組、D組比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表3 兔尺骨缺損愈合后幾何參數的變化

注：與混合細胞組比較，aP<0.05。

2.3.3 各組骨缺損區HE組織學染色 見圖6。

A—OB組第12周，新生骨內髓腔出現，逐漸向板成骨改建，但尚不完全；B—BMSCs組第12周，新生骨內髓腔出現，板成骨出現，改建不完全；C—對照組第12周，缺損區被纖維結締組織充填；D—混合細胞組第4周，骨缺損區出現島狀生長的軟骨和骨組織；E—混合細胞組第8周，新生軟骨和骨組織增多，出現板成骨；F—混合細胞組第12周缺損區修復，形成正常組織骨，骨髓腔再通。圖6 各組骨缺損區HE組織學染色結果(×40)

圖7 各組術后4、8、12周骨缺損修復X線結果

表4 4組不同時間點Lane-Sandhu法X線得分值比較分)

注：與混合細胞組同時間點比較，aP<0.05。

3 討論

本實驗通過分子生物學、標本觀察、X線及組織學檢測對BMSCs和OB體外培養的特點與構建組織工程骨體內移植后的成骨性能和成骨特點進行了評估和研究。實驗結果顯示BMSCs和OB兩種種子細胞混合后成骨性能強于單獨的任何一種細胞組，究其原因可能由于BMSCs 的分化具有位點特異性，OB可以誘導BMSCs向OB分化[8]，從而加速了骨缺損的修復進程。

3.1 種子細胞的制備 目前骨組織工程應用最廣泛的種子細胞是BMSCs，其次是OB。有關BMSCs的研究，最早可追溯到1966年Friedenstein等[9]首先發現并證實了在骨髓中除了包含造血干細胞外，還存在著一類可以向骨組織、軟骨組織、脂肪細胞、神經細胞等分化的細胞，稱之為骨髓間充質干細胞。近年來，單獨應用BMSCs或者BMSCs復合各種材料用于移植修復體內損壞或者失能的器官或組織已經取得了巨大成功。由于BMSCs具有多向分化潛能，而且來源廣泛，取材方便，分離培養、擴增以及導入外源基因等技術比較成熟，誘導分化后成骨能力明確，遺傳背景穩定，且無免疫排斥反應[10]。臨床應用的前景非常廣闊，是骨組織工程較為理想的種子細胞。OB的來源也比較廣泛，國內外學者已從胚胎或新生動物顱蓋骨、骨膜、皮質骨和松質骨、骨髓等組織中提取出OB[11-12]。但骨膜和其他骨小梁來源的OB存在取材不方便、有創傷等缺點，加上增殖能力不如骨髓來源的OB，從而限制了它們在骨組織工程中的應用。對于BMSCs和OB的原代培養，各種文獻的操作方法不一。本研究參考Stanko等[13]的操作方法，采用1.073 g·mL-1的Percoll分離液，經過3次以上傳代獲得了性能穩定、單一純化的BMSCs。OB的提取參考袁月等[14]的方法并做出了改進，短時間內建立了穩定的成骨細胞系。

3.2 膠原蛋白海綿支架材料的研究 膠原蛋白作為骨組織工程支架材料具有許多優點[15]。膠原是天然骨組織中有機質的主要成分，可為種子細胞的附著提供支架；其次，它還具有無毒、低抗原性、良好的生物相容性、可降解性和可吸收性，可以通過介導各種理化刺激來調節細胞的分化，對種子細胞的早期黏附、隨后的分化增殖以及發揮成骨功能都具有促進作用[16]。但是此種支架材料生物強度較低，力學性能較差，單獨移植用于骨缺損治療效果較差。目前的研究熱點是將膠原與BMP、HA、種子細胞或者自體骨髓等材料復合構建組織工程骨，不斷提高修復材料的機械性能和成骨性能。本研究中種子細胞BMSCs和OB接種至膠原蛋白海綿支架上，體外培養1周，細胞在支架上完全伸展并大量增殖[4]，形成具有一定強度的組織工程骨后用于移植，避免了種子細胞流失，同時也增加了膠原海綿組織工程的機械強度。

3.3 動物模型的制作 研究骨缺損的動物模型必須標準可靠并且盡可能模擬臨床情況。T?gil等[17]指出骨干連同骨膜的完全缺損，長度超過直徑的三四倍，機體就無法自行愈合，具有一般性的指導作用。參考國內外研究骨缺損模型的造模方法[5-7]，本研究采用尺骨中段1.5 cm節段性骨缺損模型。由于尺骨位置表淺，肌肉覆蓋較少，實驗中采用雙上肢尺側弧形切口，避免因傷口不愈合影響骨組織的修復。由于兔的前肢有尺橈骨組成，對于截骨區的選擇，參考顧祖超等[18]對兔尺骨解剖數據的測量結果，選取橈骨弧形頂點對應尺骨處截骨，截骨時用尖刀環形切開骨膜，使用骨科微型電鉆在上截骨點下緣和上截骨點下緣鉆孔線鋸截骨(這樣可以避免截骨過長)，然后用骨銼磨鈍骨折端，這樣截骨區遠離上下關節面，即使尺骨有較大缺損，橈骨也能起到內固定的作用，而且尺骨的直徑足夠大，結構和功能類似人類，因而可以基本模擬臨床情況。

3.4 膠原蛋白海綿組織工程化骨組織修復病理過程 Sellers等[19]將膠原海綿作為骨形態蛋白載體用于軟骨缺損的治療，Wakitani等[20]用嵌入軟骨細胞的膠原蛋白凝膠來修復軟骨缺陷。本研究使用膠原蛋白海綿復合種子細胞修復皮質骨缺損，通過形態學觀察發現兩種種子細胞可以在膠原海綿周圍生長，逐漸黏附，并在其表面形成細胞集落或團簇，隨著培養時間的延長，細胞長入孔隙內，分泌細胞外基質，細胞連接成片，膠原海綿復合體逐漸轉化為軟骨組織。研究結果顯示，膠原蛋白海綿骨植入體內后的骨折愈合過程以軟骨內化骨為主。骨折愈合是一個復雜的連續進行的過程，是OB與破骨細胞等多因素相互作用的結果，缺損區軟骨細胞逐漸增生、鈣化而骨化，在破骨細胞作用下，骨化后的骨小梁表面開始形成小腔隙，之后小腔隙逐漸相互貫通形成較大腔隙，并有血管生成，當大腔隙連接成片并與自體骨髓腔重新溝通后，即完成了骨折愈合過程。