血管內皮細胞生長因子在咬合創傷大鼠髁突軟骨的表達

叢長虹，吳立鵬

(1.天津歐瑞圣彬科技有限公司和平區口腔門診部，天津 300050； 2.佳木斯大學附屬口腔醫院 正畸科，黑龍江 佳木斯 154000)

血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是對血管內皮細胞具有高度特異性的有絲分裂原[1]，與細胞表面受體特異性結合后，產生促進新血管生成和增加血管通透性的作用，直接或間接調控血管發生、形成的各個環節，在胚胎發生、創傷愈合和腫瘤發生發展的過程中起重要作用[2]。咬合創傷是一種常見的口頜系統病理狀態，這種病理狀態不但引起牙體牙髓、牙周等病理性損害，也會對咀嚼肌、神經、顳下頜關節的改建和病變產生一定影響[3-4]。本實驗通過抬高咬合的方法建立大鼠咬合創傷動物模型，采用免疫組織化學的方法觀察了VEGF在咬合創傷不同時期髁突軟骨的表達，探討VEGF在髁突軟骨破壞和改建中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 選取2個月齡健康雄性Wistar大鼠50只，體質量240～260 g(由中國醫學科學院實驗動物中心提供)，無缺牙、牙頜畸形及嚴重牙體組織磨損，標準條件下適應性喂養1周后進行實驗。實驗動物隨機分為實驗組(包括咬合創傷7 d組、14 d組、21 d組、28 d組)和對照組，每組10只。所有實驗動物采用塊狀飼料喂養，自由飲食。

1.2 試劑 VEGF抗體(Santa Cruz，美國)，抗體稀釋液(DAKO，丹麥)，通用型生物素化IgG(DAKO，丹麥)，DAB顯色試劑盒(Santa Cruz，美國)。

1.3 實驗方法 實驗組動物采用速眠新按0.001 mL·g-1體質量行左后肢肌內注射，麻醉顯效后用自制牽引拉鉤拉開上下頜，高速手機上直徑1.0 mm金剛砂球鉆打磨粗糙右上第一磨牙合面。將預先按合面大小修整好高0.5 mm的不銹鋼舌側扣用充填用復合樹脂粘接于合面。

1.4 標本制備 對照組和各實驗組動物到達預定時間點后，行速眠新麻醉，應用40 g·L-1多聚甲醛心臟灌注固定。切取右側下頜骨髁突浸入40 g·L-1多聚甲醛液繼續固定1周，混合脫鈣液脫鈣25 h。制成5 μm厚髁突矢狀向連續石蠟切片，行HE染色和VEGF免疫組織化學染色。

1.5 免疫組織化學染色觀察 石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；于室溫下30 g·L-1H2O2孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶，切片蒸餾水洗3次；微波修復抗原：將切片浸入0.01 M、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液中微波修復抗原，5 min 3次，然后室溫冷卻；PBS緩沖液洗3次，每次5 min；滴加血清封閉液，室溫下20 min；滴加VEGF抗體，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加通用型生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min；PBS沖洗3次，每次2 min；DAB顯色，蒸餾水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，光學顯微鏡下觀察。陰性對照采用PBS代替一抗，其余步驟同上。

光鏡下，細胞內出現均勻棕色染色定義為VEGF陽性。每個實驗標本均隨機選取4個高倍視野(×400)，計數視野內陽性細胞總數，并通過公式：陽性細胞表達率=陽性細胞總數/細胞總數，計算陽性細胞表達率。

2 結果

2.1 石蠟切片HE染色結果 光學顯微鏡下，對照組髁突軟骨分為4層結構：由表及里分別為關節表面帶，主要由互相平行排列的膠原纖維構成，這些纖維與軟骨表面平行，其間可見散在纖維細胞；增殖帶，由7～10層排列比較密集的細胞構成，細胞體積較小，可見核分裂相；肥大帶，含3～5列軟骨細胞，細胞體積較大；鈣化軟骨帶，是軟骨與其下方的骨組織相互移行的部分。

實驗組咬合創傷7 d時，未見明顯的軟骨表面形態變化，增殖帶出現不同程度增厚，同時增殖帶細胞數量增多；咬合創傷14 d，軟骨表面曲度變平，增殖帶的寬度繼續增厚，并且軟骨細胞增多；咬合創傷21 d，軟骨表面變平，關節表面帶局部變得不完整，增殖帶細胞數量增多；咬合創傷28 d，軟骨出現增厚，關節表面帶不完整，增殖帶細胞呈簇狀增生，伴有軟骨層次紊亂。見圖1。

圖1 對照組(A)和咬合創傷21 d組(B)髁突軟骨(HE×200)

2.2 VEGF免疫組化染色結果 對照組VEGF陽性細胞主要分布于髁突軟骨的增殖帶和肥大帶表層。咬合創傷7 d組、21 d組VEGF在髁突軟骨各層細胞的表達均出現增強，在肥大帶的表達增強尤為明顯。見圖2。咬合創傷28 d組VEGF的表達在髁突軟骨各層均降低。各組髁突軟骨VEGF陽性細胞率統計分析見表1。

圖2 VEGF在對照組(A)和咬合創傷21 d組(B)髁突軟骨的表達(免疫組化×200)

表1 各組髁突軟骨VEGF陽性細胞率比較

注：與正常對照組相比，aP<0.05(Dunnett-t檢驗)。

3 討論

咬合創傷是由于不正常的咬合接觸關系和咀嚼系統的異常功能，造成咀嚼系統某些部位出現病理性損害或適應性變化。臨床中不均勻的磨耗，牙周病，不良修復體，以及正畸治療中均可能出現咬合創傷。咬合創傷的存在不但對受累牙的牙體、牙髓和牙周組織產生一定的影響，產生牙體磨損、折斷、牙髓病變及牙齒松動、移位、牙槽骨吸收等損害，也會影響到顳下頜關節的功能和改建。已有研究表明，嚴重的咬合創傷可引起顳下頜關節骨關節炎[5]。

在大鼠第一磨牙上粘接充填樹脂、正畸用不銹鋼方絲或金屬冠等方法是常用的建模方法[6-8]。本研究采用在大鼠右上第一磨牙上粘接預先調整的正畸用不銹鋼舌側扣的方法，使咬合抬高0.5 mm。舌側扣具有網底，易于與磨牙牢固粘接，操作簡單，且金屬材質較耐磨，便于建立穩定的咬合創傷狀態。

通過光學顯微鏡組織切片觀察，咬合創傷初期，關節軟骨表面開始出現形態變化。隨著咬合創傷的持續存在，髁突軟骨出現增厚，增殖帶細胞體積變大，數量增多及軟骨層次的紊亂，表明在咬合創傷初期，髁突軟骨表現出適應性改變，隨著咬合創傷的持續，髁突軟骨變得逐漸失去代償，進一步可能導致軟骨病理性變化。

VEGF是血管源性多肽，對血管內皮細胞具有強大的特異性的促分裂和趨化作用[9]。在軟骨的發育過程中，軟骨肥大帶細胞產生的VEGF通過與其受體結合，對發育期軟骨的血管發生和血管新生起重要作用。實驗中發現，VEGF在髁突軟骨的表達主要在增殖帶和肥大帶，咬合創傷后，髁突軟骨VEGF的表達水平逐漸增高，且在肥大帶的表達增強更為明顯。有文獻表明，關節在機械負荷的作用下，VEGF通過自分泌的方式對軟骨細胞產生影響[10]。關節軟骨是一種無血管的組織，咬合抬高后，破壞了關節的正常應力結構，導致髁突軟骨的負荷增加。咬合創傷導致的工作側髁突壓力增大，繼而誘導產生VEGF，VEGF與軟骨細胞表面受體結合后，導致基質產生破壞。結合前述的觀點可以推測，VEGF在咬合創傷髁突軟骨的改建過程中起重要作用，但確切的作用機制值得進一步探討。另外，本文僅就咬合創傷時工作側髁突軟骨的VEGF表達進行了實驗研究，非工作側VEGF的表達尚需進一步觀察。