子宮內膜癌組織Runx3、Twist1表達與臨床病理特點及預后的關系

王勁紅，杜林，蔣萍，陳英超，姜娟

哈爾濱市第一醫院，哈爾濱150010

子宮內膜癌(EC)是臨床常見女性惡性腫瘤之一[1]，早期病變局限于子宮，手術治療效果好，但對于晚期患者及復發患者，臨床治療效果及生存預后差，患者5年生存率不足30%[2]。因此深入研究EC發生發展的分子生物學機制，尋找新的EC診斷、治療及預后判斷的腫瘤標志物十分必要。RUNX家族轉錄因子3(Runx3)基因編碼含有runt結構域的轉錄因子。Runx3蛋白的異二聚體結合到靶基因的增強子或啟動子中的特異性DNA序列，或直接與其他轉錄因子相互作用，發揮轉錄激活或轉錄抑制功能，在炎癥、腫瘤及自身免疫等多種疾病中均發揮重要的調控作用[3]。近年來研究表明，在肺癌、乳腺癌及卵巢癌等多種腫瘤細胞中Runx3均存在表達降低的現象，導致下游癌基因如HOXA9等表達上調，促進腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉移[4]。Twist家族堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子1(Twist1)基因位于7p21.1，編碼蛋白具有特征性的螺旋-環-螺旋的Twist1轉錄因子，可形成同二聚體和異二聚體，與DNA 中E盒序列結合并調節胚胎發育過程，如神經管閉合、肢體發育和棕色脂肪代謝等[5]。有研究表明，腫瘤中Twist1表達升高能促進下游基因如E-鈣黏素表達降低，波形蛋白表達升高，導致腫瘤細胞發生上皮間質轉化(EMT)，腫瘤細胞浸潤、侵襲能力增強[6]。有學者在不同肝腫瘤細胞系的研究中發現，Runx3的表達與不同肝腫瘤細胞系EMT程度呈負相關，提示Runx3對Twist1表達具有抑制作用[7]。本研究通過檢測80例EC患者癌組織Runx3和Twist1的表達與臨床病理特征之間的關系，初步探討兩者對EC診治的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月～2017年6月于本院診治80例EC患者，年齡30～74(48.2±11.3)歲。病理類型：子宮內膜樣腺癌59例，黏液或漿液性腺癌21例；腫瘤大小：≤5 cm者55例，>5 cm者25例；腫瘤分化程度：高分化22例，中分化23例，低分化35例。根據2009年國際婦產科聯盟FIGO分期[8]，Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期23例；腫瘤浸潤深度：淺肌層51例，深肌層29例；伴淋巴結轉移22例，不伴淋巴結轉移58例。納入標準：①患者均經組織病理檢查明確診斷為EC；②臨床病理及隨訪資料完整；③既往未接受過放化療等其他抗腫瘤治療。排除標準：①伴有嚴重的心功能不全、肝腎功能衰竭等；②合并有其它器官的惡性腫瘤；③孕期或者哺乳期婦女。

1.2 資料收集及患者隨訪 查閱病歷，收集EC患者年齡、臨床分期、腫瘤大小、病理類型、肌層浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤分化程度等情況。自確診起開始隨訪EC患者，隨訪方式為門診復查或電話隨訪，隨訪內容包括了解患者生存情況、疾病復發情況等，隨訪截止日期2019年6月，隨訪終點為至患者死亡或隨訪結束。

1.3 EC組織Runx3、Twist1表達檢測 采用qRT-PCR法檢測組織中Runx3、Twist1表達。術中收集部分癌組織及癌旁正常組織，液氮速凍后送至實驗室，-80 ℃冰箱保存。取約50 mg組織，應用Trizol法提取組織中總RNA，步驟如下：組織低溫超聲振蕩勻漿后，離心去除下層組織碎片，加入1 mL Trizol混勻后靜置5 min，加入200 μL氯仿沉淀蛋白，靜置10 min后4 ℃下離心10 min，轉速12 000 r/min，取水相加入異丙醇沉淀RNA，4 ℃離心10 min，保留底部白色沉淀，75%乙醇洗滌，室溫下干燥RNA，取50 μL的DEPC水溶解，測定RNA的濃度及純度。以RNA為模板反轉錄，實驗步驟按照反轉錄試劑盒進行。反轉錄條件：42 ℃ 30 min，75 ℃ 5 min，得到cDNA 4 ℃條件保存。反應體系為cDNA 2 μL，Premix Taq 12.5 μL，上游和下游引物各1μL，RNA-free水20 μL體系。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。Runx3正向引物序列5′-CAGGTTCAACGACCTTCGATT-3′，逆向引物序列5′-GTGGTAGGTAGCCACTTGGG-3′。Twist1正向引物序列5′-GTGCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，逆向引物序列5′-GCTTGAGGGTCAGAATCTTGCT-3′，內參基因GAPDH正向引物序列5′-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3′，逆向引物序列5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′。Runx3、Twist1表達結果采用2值方法進行數據分析，其中Ct = CtRunx3/Twist1-CtGAPDH。

2 結果

2.1 EC組織與癌旁組織中Runx3、Twist1表達 EC組織中Runx3的相對表達量低于癌旁組織,而Twist1的相對表達量明顯高于癌旁組織(P均<0.05)。見表1。EC組織中Runx3、Twist1的表達呈明顯負相關(r=-0.611,P<0.05)。

表1 EC組織及癌旁組織Runx3、Twist1相對表達量比較

2.2 不同臨床病理特點EC患者癌組織Runx3、Twist1表達 不同臨床分期、腫瘤分化程度EC患者癌組織Runx3、Twist表達有統計學差異(P均<0.05)，不同年齡、病理類型、腫瘤大小、肌層浸潤深度及淋巴結轉移患者癌組織Runx3、Twist表達無統計學差異(P均>0.05)。見表2。

2.3 EC患者不同Runx3、Twist1表達與患者生存預后的關系 本研究中80例EC患者隨訪時間為3～36個月，中位隨訪時間29個月。所有患者隨訪期間無失訪，死亡16例，3年生存率為80.0%(64/80)。Runx3表達以0.301為界，分為高表達組41例，低表達組39例，3年總體生存率(OS)分別為90.2 %(37/41)、69.2%(27/39)，低Runx3表達組患者3年OS低于高Runx3表達組患者(χ2=4.312，P=0.043)。Twist1表達以2.016為界，分為高Twist1表達組40例，低表達組40例，3年OS分別為65.0%(26/40)、95.0%(38/40)，高Twist1表達組患者3年OS低于低Twist1表達組患者(χ2=4.717，P=0.029)。

表2 不同臨床病理特點EC患者癌組織Runx3、Twist1表達比較

3 討論

EC的發生與癌基因的過度激活、抑癌基因失活、染色體雜合性缺失(LOH)及表觀遺傳學修飾等機制有關，尋找參與EC發生發展中關鍵基因表達異常及基因表達調控，是近年來EC研究的熱點[9，10]。

RUNX家族成員包括RUNX1、RUNX2和RUNX3，均具有高度保守的同源N末端runt結構域，該結構域包括約120個氨基酸的DNA結合和異二聚化區域。其中RUNX3基因位于1p36.11，參與多種生物活動，包括胃腸道發育、背根神經節發生和T細胞分化等。RUNX3作為一種抑癌基因，其RUNX3表達在腫瘤中發揮腫瘤抑制因子的作用。在多種腫瘤中RUNX3表達降低，參與促進腫瘤的發生發展[11]。本研究中，EC患者癌組織中RUNX3的相對表達量顯著較癌旁組織低，目前具體機制尚不清楚，可能與1p36染色體LOH有關。研究表明，在肝癌、肺癌等多種腫瘤中1p36發生LOH時，RUNX3基因表達沉默，促進腫瘤細胞惡性增殖與進展[12]。此外，EC癌組織中RUNX3的表達與腫瘤分期及腫瘤分化程度有關，腫瘤分期越高、分化程度越差，癌組織中RUNX3的表達下降越明顯，表明RUNX3的表達參與EC的發生發展。一方面，RUNX3能夠結合并促進miR-182的表達，而miR-182表達抑制同源框A9(HOXA9)基因的表達，最終發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用；而腫瘤發生時RUNX3表達降低，導致miR-182對HOXA9表達的抑制作用減弱，促進腫瘤細胞惡性增殖，導致腫瘤分期增高[13]。另一方面，RUNX3對EMT具有負性調控作用，RUNX3表達降低后，抑制miR-6780表達，導致miR-6780對靶基因E-鈣粘蛋白3′非翻譯區結合減少，E-鈣粘蛋白表達升高，促進腫瘤的局部浸潤，腫瘤分化程度降低[14]。本研究結果低RUNX3表達組患者3年總體生存率明顯降低，提示EC患者不良生存預后，因而癌組織中RUNX3表達水平有可能成為判斷患者預后的分子標志。

Twist1是螺旋-環-螺旋轉錄因子家族的成員，是誘導EMT的主要轉錄因子之一，在胚胎發育期影響細胞遷移。Twist1在多種類型的癌細胞中表達升高，Twist1過表達可以通過抑制p53和Rb依賴性途徑的關鍵調節因子抑制細胞凋亡，影響癌細胞生物學行為[15]。本研究中，EC患者癌組織中Twist1的表達量明顯高于癌旁組織，表明EC患者癌組織中Twist1表達升高。其原因可能是腫瘤微環境中細胞因子如TGF-β分泌增多，結合于腫瘤細胞表面的相應受體，激活EMT信號傳導通路，促進Twist1基因的表達[16]。本研究表明Twist1表達與腫瘤分期及腫瘤分化程度有關。其機制可能是轉錄因子Twist1能夠直接激活 Smad3信號通路，進而激活下游的絲裂原激活的蛋白激酶途徑，增強腫瘤細胞增殖、遷移及浸潤能力，導致腫瘤分期升高。另外，Smad3能激活核因子κB途徑信號，促進EMT的發生，導致腫瘤細胞極性改變及骨架重排，腫瘤細胞分化程度降低，易發生浸潤和轉移[17]。本研究中高Twist1表達水平患者3年總體生存率明顯較低，表明EC癌組織Twist1高表達與患者的不良生存預后有關，癌組織Twist1表達有可能成為判斷EC患者預后的重要指標。本研究中EC患者癌組織中Runx3與Twist1表達呈負相關，其機制與Runx3對Twist1的直接或間接表達調控作用有關。一方面，Runx3表達降低后能夠促進Wn信號通路的活化，促進下游EMT相關基因的表達，導致Twist1表達升高。另一方面，Runx3可作為調控Twist1表達的負性調節因子，Runx3表達降低后導致Twist1表達水平升高，促進腫瘤惡性進展。

綜上所述，EC患者癌組織中Runx3表達下降，而Twist1表達升高，兩者表達與腫瘤分期、腫瘤分化程度及預后有關，有望成為新的EC的腫瘤標志物。但二者在EC診斷、治療及預后判斷中的臨床價值有待進一步深入研究。