LncRNA ASB16-AS1調控前列腺癌細胞增殖轉移的分子機制

郭宗華，孔東波，江波濤，鄒偉，饒志剛，趙克棟

咸寧市中心醫院 湖北科技學院附屬第一醫院，湖北咸寧 437100

近年來，前列腺癌發病率逐年上升[1],其發病及轉移機制尚未完全闡明。研究表明，長鏈非編碼RNA(LncRNA)可通過競爭性結合微小RNA(miRNA)從而調控細胞增殖、分化、遷移等生物學過程[2～4]。長鏈非編碼RNA ASB16-AS1(LncRNA ASB16-AS1)在膠質瘤中表達上調，并可促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲[5]，但ASB16-AS1在前列腺癌中的表達及其調控機制尚未可知。生物信息學分析顯示微小RNA-760(miR-760)可能是ASB16-AS1的靶基因，miR-760在胃癌、非小細胞肺癌中表達下調，并可調節細胞增殖、遷移等生物學行為[6-7]。但ASB16-AS1是否可通過調控miR-760表達從而參與前列腺癌發生發展過程尚不清楚。2014年1月～2018年12月，我們探討ASB16-AS1、miR-760表達變化對細胞增殖、遷移及侵襲的作用，分析ASB16-AS1與miR-760的靶向調控作用，以期揭示前列腺癌發生及發展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 前列腺癌細胞株LNCaP購自美國ATCC細胞庫；杜氏改良培養基(DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；Trizol、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；ASB16-AS1小干擾RNA(si-ASB16-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-760寡核苷酸模擬物(miR-543 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；miR-760特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-760)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；pcDNA3.1購自上海柯雷生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(MTT)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；RIPA裂解液購自北京全式金生物技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；增強型化學發光試劑購自北京諾特萊斯生物科技有限公司；兔抗人細胞周期蛋白1(CyclinD1)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、p21抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養、轉染及分組 前列腺癌LNCaP細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2培養，待細胞生長密度達到80%左右時進行傳代。取對數期LNCaP細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養基制備細胞懸液，調整細胞密度1×104個/mL，接種于6孔板(200 μL/孔)，待細胞生長融合度達到70%時將培養基更換為不含血清的培養基。參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將si-NC、si-ASB16-AS1、miR-NC、miR-760 mimics、si-ASB16-AS1與anti-miR-NC、si-ASB16-AS1與anti-miR-760轉染至LNCaP細胞，分別命名為si-NC組、si-ASB16-AS1組、miR-NC組、miR-760組、si-ASB16-AS1+anti-miR-NC組、si-ASB16-AS1+anti-miR-760組。轉染6 h后將培養基更換為含有血清的DMEM培養基，繼續培養48 h，收集對數期細胞進行后續研究。

1.3 ASB16-AS1、miR-760表達檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法。以Trizol法提取轉染后各組LNCaP細胞中的總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度，根據反轉錄試劑盒說明書操作將總RNA反轉錄合成cDNA。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，參照熒光定量PCR試劑盒說明書配置反應體系。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環40次。ASB16-AS1以GAPDH為內參，miR-760以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算ASB16-AS1、miR-760的表達水平。

1.4 細胞增殖檢測 采用MTT法。收集各組對數期LNCaP細胞(5×103個/mL)，接種至96孔板(100 μL/孔)，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜，應用酶標儀檢測培養24、48、72 h各孔波長為490 nm處的相對吸光度(OD)值。

1.5 細胞遷移與侵襲檢測 細胞遷移實驗：收集各組對數期LNCaP細胞接種于Transwell小室的上室(200 μL/孔)，Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培養液(600 μL/孔)，37 ℃培養箱內培養24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察遷移細胞數。細胞侵襲實驗：預冷培養基按照1∶8比例稀釋Matrigel基質膠，37 ℃培養箱孵育5 h，Matrigel基質膠按照每孔40 μL的密度接種于Transwell小室的上室，后續實驗步驟同細胞遷移實驗，顯微鏡下觀察侵襲細胞數。

1.6 ASB16-AS1靶基因檢測 將含有結合位點與突變位點的序列插入熒光素酶報告基因載體分別構建野生型載體WT-ASB16-AS1、突變型載體MUT-ASB16-AS1，參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將WT-ASB16-AS1、MUT-ASB16-AS1與miR-NC、miR-760 mimics共轉染至LNCaP細胞，37 ℃培養箱繼續培養48 h，檢測各組熒光素酶活性。參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書分別將pcDNA、pcDNA-ASB16-AS1、si-NC、si-ASB16-AS1轉染至LNCaP細胞，采用qRT-PCR法檢測各組細胞中miR-760的表達水平。

1.7 CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達檢測 采用Western blotting法。 收集各組對數期LNCaP細胞，加入RIPA裂解液，冰浴30 min，4 ℃條件下經3 000 r/min離心10 min，提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后點樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜、封閉，加入蛋白一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，洗膜，加入IgG二抗(1∶2000)，ECL顯影，應用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 LncRNA ASB16-AS1表達抑制對LNCaP細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-ASB16-AS1組LNCaP細胞中ASB16-AS1的表達水平降低，細胞增殖活力降低，遷移、侵襲細胞數減少，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 LncRNA ASB16-AS1表達抑制對LNCaP細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.2 miR-760過表達對前列腺癌LNCaP細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-760組LNCaP細胞中miR-760的表達水平升高，細胞增殖活力降低，遷移細胞數與侵襲細胞數減少，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-760過表達對LNCaP細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.3 LncRNA ASB16-AS1 對miR-760的靶向調控作用 雙熒光素酶報告實驗結果顯示，轉染野生型載體WT-ASB16-AS1的細胞實驗中，miR-NC組、miR-760組熒光素酶活性分別為1.04±0.09、0.53±0.05，miR-760組熒光素酶活性低于miR-NC組(t=14.861，P<0.05)；轉染突變型載體MUT-ASB16-AS1的細胞實驗中，miR-NC組、miR-760組熒光素酶活性分別為1.02±0.08、1.00±0.07，miR-760組熒光素酶活性與miR-NC組相比差異無統計學學意義(t=0.564，P>0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示，pcDNA組、 pcDNA-ASB16-AS1組、si-NC組、si-ASB16-AS1組miR-760表達分別為1.00±0.09、0.49±0.05、0.98±0.08、2.46±0.25，組間差異有統計學意義(F=328.434，P<0.05)。與pcDNA組相比，pcDNA-ASB16-AS1組細胞中miR-760表達水平降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-ASB16-AS1組細胞中miR-760表達水平升高(P<0.05)。

2.4 miR-760低表達對LNCaP細胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達的影 與si-ASB16-AS1+anti-miR-NC組相比，si-ASB16-AS1+anti-miR-760組LNCaP細胞中miR-760的表達水平降低，細胞增殖活力增強，遷移細胞數與侵襲細胞數增多，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，p21蛋白水平降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表3、表4。

表3 miR-760低表達對LNCaP細胞增殖、遷移、侵襲的影響

注：與si-NC組比較，*P<0.05；與si-ASB16-AS1+anti-miR-NC組比較，#P<0.05。

表4 miR-760表達降低對LNCaP細胞蛋白表達的影響

注：與si-NC組比較，*P<0.05；與si-ASB16-AS1+anti-miR-NC組比較，#P<0.05。

3 討論

LncRNA在前列腺癌發生及發展過程發揮重要調控作用，可影響細胞增殖、凋亡、遷移等生物學過程[8～10]。研究表明，ASB16-AS1可通過調節miR-1827/ FZD4分子軸促進肝細胞癌的生長和侵襲[11]，也可促進神經膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲[12]。有研究指出，在腫瘤組織中 CyclinD1呈高表達、p21蛋白低表達可促進細胞增殖[13]。本研究通過體外細胞實驗分析ASB16-AS1在前列腺癌發生過程中的分子機制，顯示抑制ASB16-AS1表達后，前列腺癌細胞增殖活力顯著降低，CyclinD1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高。提示抑制ASB16-AS1表達可能通過上調p21表達及下調CyclinD1表達從而抑制前列腺癌細胞增殖。研究表明，作為基質金屬蛋白酶家族成員，MMP-2、MMP-9可降解細胞外基質沉積從而促進腫瘤細胞遷移及侵襲[14]。本研究結果顯示，抑制ASB16-AS1表達后，前列腺癌細胞遷移及侵襲能力明顯減弱，MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯降低，提示抑制ASB16-AS1表達可能通過下調MMP-2、MMP-9表達從而抑制前列腺癌細胞遷移及侵襲。

研究表明，miR-760通過靶向BATF3/AP-1/cyclinD1信號通路抑制大腸癌的生長[15]，LncRNA LOC730100通過競爭性結合miR-760而促進神經膠質瘤細胞增殖及侵襲[16]，LncRNA SNHG6通過競爭性結合miR-760而促進結直腸癌的發展[17]，miR-760通過靶向ROS1抑制非小細胞肺癌的增殖及轉移[18]。本研究結果顯示，miR-760在前列腺癌組織中表達下調，miR-760過表達后前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力明顯減弱，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，提示miR-760過表達可能通過調控CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達從而抑制前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。同時本研究通過雙熒光素酶報告實驗、qRT-PCR實驗證實，ASB16-AS1可靶向結合miR-760，并可負向調控miR-760的表達，進一步研究顯示干擾miR-760的表達可降低ASB16-AS1表達對前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響。通過上調miR-760的表達從而抑制ASB16-AS1表達，可減弱前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力。

綜上所述，前列腺癌中ASB16-AS1表達上調，miR-760表達下調，ASB16-AS1可通過靶向干擾miR-760表達從而促進前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲，ASB16-AS1可能作為前列腺癌靶向治療的潛在靶點。