OX40L對兒童哮喘和哮喘小鼠模型輔助性T細胞分化的影響①

林香花 王思勤 張秋興 劉 丹

(河南省人民醫院變態反應科,鄭州大學人民醫院,鄭州 450000)

哮喘是一種過敏性疾病，其特征是慢性氣道發炎、氣流受限和氣道高反應性。哮喘的確切病因尚不清楚。多年來研究表明，Th1、Th2、Treg和Th17細胞功能障礙在過敏性哮喘中起關鍵作用，Th1細胞和Th17細胞主要分泌促炎細胞因子IFN-γ和IL-17，而Th2細胞和Treg細胞主要分泌抑炎細胞因子IL-4和TGF-β。當T細胞亞群從Th1向Th2漂移或Th17細胞減少而Treg細胞增加時，炎癥反應被抑制，反之則加劇炎癥反應。OX40L/OX40的相互作用有助于Th1、Th2、Treg和Th17細胞的分化并維持哮喘的免疫功能平衡[1]。OX40L(CD252，TNFSF4)最初被稱為糖蛋白34 kD(GP34)，屬于TNF超家族，主要在抗原呈遞細胞(APC)的表面表達，包括活化的樹突狀細胞(DCs)、B細胞、巨噬細胞、T細胞以及內皮細胞[2-4]。OX40(ACT35，CD134，TNFRSF4)在活化的CD4+T細胞的表面表達[5,6]。它可以與OX40L特異性結合并引發一系列反應，這些反應有助于促進CD4+T細胞的增殖和存活以及細胞因子的分泌[7]。

輔助性T細胞亞群(Th1/Th2)失調是哮喘的關鍵發病機制。在正常情況下，Th1和Th2細胞之間的相互抑制有利于體內免疫應答的平衡[8-10]。Th2型免疫應答是由包括IL-4在內的細胞因子介導的，從而促進過敏原致敏和超敏反應的發生[11]。Th2細胞可以分泌IL-4，并拮抗Th1細胞的產生及IFN-γ 的分泌，從而進一步促進哮喘的發展[12]。也有一些研究認識到Th1/Th2失衡不能完全解釋哮喘的病因，其他CD4+T細胞亞群可能與哮喘有關，包括Th17細胞和Treg細胞[12]。Th17和Treg之間的不平衡可能在過敏性氣道炎癥中也起著關鍵作用，通常會促發嗜中性粒細胞炎癥[13]。另一方面，Treg細胞通過抑制炎癥反應來調節對過敏原的免疫應答并維持免疫穩態。因此，OX40/OX40L在調節哮喘中Th1/Th2和Th17/Treg的平衡中起著至關重要的作用[14]。

此外，最近的研究表明，哮喘的病因與某些分子和轉錄因子有關。研究表明，PI3K/AKT信號通路可能在調節哮喘氣道平滑肌細胞的增殖中起著至關重要的作用[15]。LY294002是一種特殊的PI3K抑制劑，能夠在鼠哮喘模型中顯著下調Akt磷酸化并抑制炎性細胞浸潤、黏液產生和氣道高反應性。氣管內給予LY294002能夠減少哮喘小鼠的氣道炎癥[16]。

此外，最近的研究表明，OX40/OX40L的相互作用可能通過調節Th1和Th2細胞相關的信號通路促進免疫應答[17]。本研究旨在探討OX40L對哮喘細胞免疫過程中輔助性T細胞分化的影響，并考察OX40L是否可以通過PI3K/AKT信號通路誘導輔助性T細胞分化。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料 Percoll 細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；卵清蛋白(OVA)、OX40L、IL-4、IFN-γ和IL-17以及TGF-β ELISA試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；抗p-AKT、AKT、p-p38、p38和GAPDH的一抗購自美國Cell Signaling公司；自動磁選和抗CD4微珠分離試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司；流式細胞儀、PE抗Foxp3、OX40L-Ig融合蛋白、同型對照IgG、抗小鼠-OX40L單克隆抗體(mAb)購自美國Biolegend公司；ECL試劑蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；LSC-LB7低本底液體閃爍計數系統購自日立Aloka公司。

1.1.2研究對象 2019年3月至8月期間，分別收集我院收治的20例急性期哮喘患兒和20例穩定期哮喘患兒，男女各半。急性期哮喘患兒年齡為5～13歲，平均(8.35±2.56)歲。穩定期哮喘患兒年齡為6～13歲，平均(8.41±2.17)歲。另外選擇20例同期體檢的健康兒童作為對照組，男女各半，年齡為6～12歲，平均(8.52±1.53)歲。三組的人口統計學資料無顯著差異(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血清樣本檢測 使用酶聯免疫吸附(ELISA)方法測量血清中的OX40L、Th1(IFN-γ)、Th2(IL-4)、Th17(IL-17)以及Treg(TGF-β)細胞因子水平。

1.2.2致敏細胞中OX40L表達的檢測 參考文獻[18]分離外周血單個核細胞(PBMC)。通過Percoll 細胞分離液從昆明小鼠的外周血樣本中分離出外周單個核細胞。采集EDTA抗凝外周血，采用Percoll 細胞分離液通過密度梯度離心法分離外周單個核細胞。將外周血離心后在距白細胞層5 mm左右停止血漿提取,使用無菌吸管向剩余標本中加入等體積RPIM1640培養基稀釋混勻，將稀釋后血液加入裝有細胞分離液的離心管中，4 000 r/min 室溫離心15 min，棄上清液，將細胞與RPMI1640培養基及終濃度為1 mg/ml的OVA加入到24孔培養板中，調整細胞濃度為 1×106個/孔，每孔總體積 2 ml。然后刺激48 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照。使用ELISA方法測量上清液中的IL-4、IFN-γ和IL-17以及TGF-β水平。并通過ELISA試劑盒檢測OX40L在細胞表面上的表達。

1.2.3蛋白磷酸化測定 在裂解緩沖液中制備OVA處理細胞的蛋白質提取物，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉移到硝酸纖維素膜上。封閉膜2 h后與抗p-AKT、AKT、p-p38、p38和GAPDH的一抗一起孵育，然后與HRP標記的二抗一起孵育。使用ECL試劑進行顯影，GAPDH作為內部對照。

1.2.4OX40L對輔助性T細胞分化的影響 通過自動磁選和抗CD4微珠分離試劑盒分離和純化CD4+T細胞。所有分選的細胞群的純度大于95%。將OVA誘導的CD4+T細胞與OX40L-Ig融合蛋白或對照IgG分別孵育48 h。為了估計T細胞的增殖，在48 h 培養的最后12 h內添加3H-TdR。收獲細胞并計數。通過ELISA測量上清液中的IL-4、IFN-γ、IL-17和TGF-β水平。使用FITC抗CD4、PE抗IFN-γ、PE抗IL-4、PE抗IL-17對Th1、Th2和Th17進行流式細胞分析。Treg細胞用FITC抗CD4和PE抗CD25染色標記，然后與PE抗Foxp3一起孵育。

1.2.5OX40L調節輔助性T細胞分化的信號通路 分別用OX40L-Ig融合蛋白或對照IgG誘導OVA誘導的CD4+T細胞48 h。 Western blot檢測AKT和p38的表達和磷酸化。此外，將OVA誘導的CD4+T細胞與OX40L-Ig融合蛋白或對照IgG孵育48 h后，加入PI3K/Akt抑制劑LY294002(終濃度50 μmol/L)或p38MAPK抑制劑SB203580(終濃度50 μmol/L)。然后，在48 h培養的最后12 h內添3H-TdR(終濃度1 mCi/ml)。收集細胞并用液體閃爍計數系統進行計數。上清液中的IL-4、IL-17、加IFN-γ和TGF-β水平通過ELISA進行測量。通過流式細胞術測量Th1、Th2、Th17和Treg的細胞計數。

1.2.6小鼠哮喘實驗模型的誘導 昆明小鼠購自南京醫科大學實驗動物中心，將小鼠飼養在25℃、55%相對濕度、12 h光暗循環照明的無菌飼養室內，給予標準小鼠飼料及純凈水，不限制飲食。為了誘導昆明小鼠哮喘實驗模型，將100 mg/ml OVA用200 mg/ml氫氧化鋁-生理鹽水溶液乳化，在第0、7和14天通過腹腔內注射0.1 ml 0.5%的OVA溶液對小鼠進行OVA致敏，然后在第22、24、26和28天進行0.5% OVA霧化吸入30 min。將生理鹽水代替OVA處理小鼠作為對照。

1.2.7OX40L-Ig融合蛋白給藥 為了評價OX40L的作用，在OVA致敏的第0、3、7、10和14天，對小鼠模型腹腔注射OX40L-Ig融合蛋白、同型對照IgG或抗小鼠-OX40L單克隆抗體(mAb)。最后一次激發24 h后,以10%水合氯醛(300 mg/kg)行腹腔注射，然后脫頸椎處死小鼠，并收集肺組織和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。

1.2.8細胞因子的檢測及HE染色 ELISA法檢測BALF中IL-4、IL-17、IFN-γ和TGF-β水平。通過FCM分析小鼠外周血Th細胞的數目；將小鼠肺組織用10%多聚甲醛固定并進行HE染色評價病理改變。

2 結果

2.1OX40L在患者血清中的表達 如表1所示，與穩定期哮喘或健康對照受試者相比，急性期哮喘患者的OX40L、IL-4和IL-17水平明顯增加，而IFN-γ 和TGF-β明顯降低。該結果提示OX40L在哮喘中起著至關重要的作用。

2.2OX40L在OVA誘導的小鼠單個核細胞中的表達 本研究檢測了OVA誘導的小鼠單個核細胞中OX40L的表達，結果表明OVA組的OX40L的表達明顯高于PBS對照組(表2)。同樣，OVA組的IL-4和IL-17的表達也比PBS對照組高，然而，OVA組的IFN-γ和TGF-β則明顯降低。此外，OVA組Akt磷酸化水平也明顯升高(圖1)。

2.3OX40L通過PI3K/AKT信號誘導輔助性T細胞分化 如表3所示，與對照相比，OVA組中CD4+T細胞的增殖明顯增加，當用OX40L-Ig融合蛋白處理時，CD4+T細胞的增殖進一步增加。在OVA組和OVA+OX40L-Ig組中， IL-4和IL-17的水平升高， 而IFN-γ和TGF-β的水平降低。同樣，OVA組和OVA+OX40L-Ig組中Th2和Th17的數量增加，而Th1和Treg的數量減少。此外，如圖2所示，OVA誘導的CD4+T細胞中Akt的磷酸化水平升高，而OX40L-Ig融合蛋白處理的OVA誘導的CD4+T細胞中Akt的磷酸化水平進一步升高。以上結果表明PI3K/Akt信號通路可能與OX40L誘導的輔助T細胞分化有關。

IndexControlAcute asthmaStable asthmaOX40L(ng/L)4.50±0.357.30±0.561)4.47±0.342)IL-4(ng/L)1.17±0.094.64±0.361)2.64±0.201)2)IL-17(ng/L)11.30±0.8722.67±1.741)15.70±1.211)2)IFN-γ(ng/L)15.70±1.219.54±0.731)13.11±1.012)TGF-β(ng/L)62.56±4.8141.46±3.191)52.80±4.061)2)

Note:Compared with control group，1)P<0.05;compared with acute asthma group，2)P<0.05.

IndexPBSOVAOX40L(ng/L)2.32±0.185.46±0.421)IL-4(ng/L)54.36±4.18114.63±8.821)IL-17(ng/L)1.43±0.113.62±0.281)IFN-γ(ng/L)1.64±0.130.95±0.071)TGF-β(ng/L)6.36±0.494.63±0.361)

Note:Compared with PBS group，1)P<0.05.

圖1 Western blot檢測p-Akt和total-Akt蛋白表達Fig.1 Western blot analysis of p-Akt and total-Akt protein expressionNote:Compared with PBS groups,*.P<0.05.

IndexControlOVAOVA+OX40L-Ig3H-TdR uptake (cpm×103)2.44±0.186.36±0.471)10.64±0.781)2)IL-4(ng/L)64.35±4.7198.56±7.221)135.64±9.941)2)IL-17(ng/L)1.32±0.102.54±0.191)4.18±0.311)2)IFN-γ(ng/L)1.64±0.121.13±0.081)0.65±0.051)2)TGF-β(ng/L)6.47±0.473.17±0.231)1.59±0.121)2)Th1(%)11.64±0.855.75±0.421)2.09±0.151)2)Th2(%)5.74±0.4211.58±0.851)16.34±1.21)2)Th17(%)2.53±0.194.57±0.331)6.74±0.491)2)Treg(%)7.75±0.574.67±0.341)2.35±0.171)2)

Note:Compared with control group，1)P<0.05;compared with OVA group，2)P<0.05.

2.4PI3K/AKT信號抑制劑誘導輔助性T細胞分化 本研究應用PI3K/Akt抑制劑LY294002處理OVA誘導的CD4+T細胞。如表4所示，LY294002處理后，OVA誘導的CD4+T細胞中IL-4、IL-17以及Th2和Th17細胞的數量明顯減少。說明LY294002可以抑制OVA誘導的Th2和Th17細胞增殖。相反，LY294002顯著升高了IFN-γ和TGF-β的表達以及Th1細胞和Treg細胞的數量。說明LY294002可以促進OVA誘導的Th1和Treg細胞的增殖。

2.5OX40L誘導哮喘小鼠模型輔助性T細胞分化實驗 為了確定OX40L在輔助性T細胞分化中的作用，本研究建立了哮喘小鼠模型。如表5所示，當對照組和OVA組相比時，用OX40L-Ig融合蛋白處理的OVA誘導的小鼠哮喘模型BALF中的IL-4和IL-17水平以及小鼠外周血Th2和Th17細胞的數目顯著增加，而IFN-γ和TGF-β水平以及Th1和Treg細胞的數目顯著減少。相反，當用抗小鼠OX40L單抗處理時，與OVA+OX40L 組相比，IL-4和IL-17水平以及Th2和Th17細胞的數量顯著減少，而IFN-γ和TGF-β水平以及Th1和Treg細胞的數量明顯增加。這些結果表明，OX40L的缺失可以抑制Th2和Th17細胞的分化。

圖2 Western blot檢測OX40L-Ig融合蛋白對Akt磷酸化的影響Fig.2 Western blot analysis of effect of OX40L-Ig fusion protein on Akt phosphorylationNote:Compared with control group，*.P<0.05;compared with OVA group，#.P<0.05.

IndexControlPI3K inhibitor3H-TdR uptake (cpm×103)8.45±0.624.36±0.321)IL-4(ng/L)157.75±11.5662.85±4.601)IL-17(ng/L)3.67±0.271.16±0.081)IFN-γ(ng/L)0.75±0.051.67±0.121)TGF-β(ng/L)2.53±0.195.28±0.391)Th1(%)2.64±0.196.42±0.471)Th2(%)13.86±1.025.84±0.431)Th17(%)6.38±0.472.74±0.201)Treg(%)2.53±0.197.22±0.531)

Note:Compared with control group,1)P<0.05.

IndexControlOVAOVA+IgGOVA+OX40LOVA+Anti-OX40LIL-4(ng/L)6.35±0.4715.56±1.141)14.86±1.091) 22.64±1.661)2)3) 7.89±0.581)2)3)4)IL-17(ng/L)71.67±5.25108.46±7.951)105.75±7.751) 147.85±10.831)2)3)76.90±5.632)3)4)TGF-β(ng/L)423.86±31.05312.86±22.921)308.64±22.611)207.75±15.221)2)3)388.76±28.481)2)3)4)IFN-γ(ng/L)154.64±11.3389.67±6.571)87.56±6.411) 46.85±3.431)2)3)112.96±8.281)2)3)4)Th1(%)8.46±0.626.46±0.471)6.54±0.481) 3.26±0.241)2)3)7.04±0.521)2)3)4)Th2(%)4.24±0.315.34±0.391)5.13±0.381) 7.45±0.551)2)3)4.47±0.332)3)4)Th17(%)2.16±0.164.24±0.311)4.57±0.331) 5.76±0.421)2)3)3.04±0.221)2)3)4)Treg(%)8.15±0.606.36±0.471)6.42±0.471) 4.32±0.321)2)3)7.93±0.582)3)4)

Note:Compared with control group，1)P<0.05;compared with OVA group，2)P<0.05；compared with OVA+IgG group，3)P<0.05；compared with OVA+OX40L group，4)P<0.05.

圖3 HE染色檢測OX40L-Ig融合蛋白和抗小鼠OX40L單抗對哮喘小鼠肺組織病變的影響(×200)Fig.3 Effect of OX40L-Ig fusion protein and anti-mouse OX40L monoclonal antibody on lung tissue lesions in asthmatic mice by HE staining (×200)

為了確定OX40L-Ig融合蛋白和抗小鼠OX40L單抗對哮喘小鼠肺組織病變的影響，采用HE染色評價肺組織病變，如圖3所示，OVA模型組和OVA+IgG組可見炎癥細胞浸潤明顯增加，尤其是血管周圍和支氣管周圍的淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，上皮下基底層增厚。此外，在用OX40L-Ig融合蛋白處理組中，炎癥細胞浸潤進一步加劇。相反，在用抗小鼠OX40L單抗處理后，肺組織中嗜酸性粒細胞的浸潤明顯減少，并且基底層上皮增厚情況顯著減輕。

3 討論

支氣管哮喘是一種由多種炎癥細胞和介質引起的氣道過敏性炎癥。炎癥細胞和釋放的介質在復雜的哮喘病原學中起著重要的作用。本研究探討了OX40L在哮喘中的作用機理。研究發現OX40L在哮喘患者中的表達顯著升高，這表明OX40L與哮喘相關。其他研究發現，哮喘兒童在急性發作期的OX40L水平顯著高于中度和輕度哮喘急性發作的兒童[19]。此外，與健康對照組相比，輕度哮喘患者中OX40、OX40L和IL-4水平也顯著增加[20]。

Th1/Th2細胞和Th17/Treg細胞的平衡與哮喘的發病過程密切相關。Th1細胞和Th17細胞主要分泌細胞因子IFN-γ和IL-17，而Th2細胞和Treg細胞主要分泌細胞因子IL-4和TGF-β。本研究發現急性期哮喘患者的IL-4和IL-17水平明顯增加，而IFN-γ和TGF-β明顯降低。并且OVA誘導的單個核細胞中的IL-4和IL-17的表達也顯著升高，而IFN-γ和TGF-β則明顯降低。表明OVA誘導了Th1/Th2細胞和Th17/Treg細胞的失平衡。

本研究還發現OVA誘導的單個核細胞中OX40L水平升高，這表明OX40L在輔助性T細胞誘導的哮喘反應中起重要作用。具體而言，OX40/OX40L相互作用在T細胞分化中起潛在作用，并影響Th1/Th2的平衡[21]。OX40L可以激活T細胞表達IL-4，并抑制IFN-γ的表達，從而參與免疫細胞介導的Th2型免疫應答[22]。另外，OX40L還可以誘導Th17細胞表達IL-17從而促進Th17型免疫應答，以及阻止Treg的分化并阻斷其功能[23]。

多項研究顯示，與哮喘有關的信號傳導途徑，例如酪氨酸激酶信號傳導級聯在過敏性氣道炎癥中起著至關重要的作用，而GM-CSF STAT5途徑的激活延遲了哮喘患者肺粒細胞的凋亡[24-26]。此外，據報道，TGF-β信號在哮喘氣道中高表達，并且TGF-β信號的激活可以促進哮喘氣道重塑[27]。而PI3K/AKT信號也可促進哮喘的進展。各種研究表明，抑制PI3K/Akt信號傳導可減輕過敏性哮喘的嚴重程度[28]。本研究發現OX40L可顯著激活OVA誘導的單個核細胞以及CD4+T細胞中的Akt磷酸化，此外，本研究應用PI3K/Akt抑制劑LY294002處理OVA誘導的CD4+T細胞，發現抑制PI3K/Akt信號可明顯降低OVA誘導的IL-4和IL-17水平以及Th2和Th17細胞的數量，但可升高IFN-γ和TGF-β的表達以及Th1和Treg細胞的數量。表明PI3K/Akt信號通路介導OX40L誘導的輔助性T細胞的分化。

本研究建立了哮喘小鼠模型，并分別用OX40L-Ig融合蛋白和抗小鼠OX40L單抗處理小鼠，發現OX40L-Ig融合蛋白處理可加劇哮喘小鼠肺組織中炎癥細胞浸潤，而用抗小鼠OX40L單抗處理則可抑制肺組織病變。進一步證實OX40L在哮喘發生中的促進作用。OX40/OX40L信號參與調控Th1、Th2、Treg和Th17細胞的增殖和分化，并且介導哮喘發病過程中的重要促炎或抗炎細胞因子的表達，研究OX40/OX40L信號作為Th細胞第二信號的具體生物學功能有利于進一步揭示哮喘的發病機制。

總之，本研究表明，OX40L通過PI3K/Akt信號通路誘導了Th2和Th17細胞的分化，用抗小鼠OX40L單抗阻斷OX40L可以誘導哮喘中的Th1和Treg細胞分化。